乳品污染菌的基因组学研究及其在生产控制上的应用

王丽群，国立东

（1.黑龙江省农业科学院食品加工研究所，哈尔滨150086；2.黑龙江中医药大学药学院，哈尔滨150040）

0 引言

自乳品工业兴起以来，就有了涉及乳品和乳制品的食品中毒和引发其他疾病的报道，自1972年到2000年，美国共发生58起鲜奶致病事件，每年平均约2起。乳品污染事件的“罪魁祸首”多以鲜奶中的沙门氏菌、李斯特菌以及空肠弯曲菌为主。多年来与乳中污染菌检测、定量及鉴定等方面研究较多，目前，公开数据库可查询的微生物全基因组总数可达566个，不完整的基因组841个，还有许多未经记录菌株。随着基因组学和基因组学相关技术的发展，越来越多的基因组信息将公布于众，此外，基因组信息学对人们认识新的细菌性状、菌株对环境适应所产生的突变基因以及新的检测技术的开发方面都会提供很多帮助。

1 乳中常见污染细菌及其基因组序列的研究情况

早期通过乳品传播的疾病主要有结核、白喉和猩红热等，近年来的研究就主要集中在乳中传播的多种致病性细菌和腐败细菌上。乳及乳制品营养丰富且pH值近中性等特点为许多微生物包括病原细菌和腐败细菌提供了良好培养基。乳中污染细菌大致可以分为三类，即人源致病菌，包括空肠弯曲杆菌、肠出血性大肠杆菌[1]、沙门氏菌属[2]、单核细胞增生李斯特氏菌[3]、蜡样芽孢杆菌和小肠结肠炎耶尔森（氏）菌等；能够引起牛乳房炎的微生物，如乳房链球菌、人源致病菌金黄色葡萄球菌[4]和无乳链球菌等；还有腐败微生物（非致病细菌）多种嗜冷菌及芽孢杆菌，如嗜冷性荧光假单胞菌[5]、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。从研究结果来看，目前许多细菌已经获得全基因组序列，包括上述的一些人类病原菌和腐败微生物，但是这些菌株中只有少部分测序菌株是直接分离于乳制品的。细菌基因组学的一个重要应用就是能够对微生物安全及食品质量加以控制。

1.1 乳中人源致病菌基因组学

人源致病菌的典型测序菌株包括分离自干酪的蜡状芽孢杆菌[6]和单核细胞增生李斯特氏菌[3,7]及分离自原料乳的高毒性空肠弯曲杆菌[8]。

蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和炭疽芽孢杆菌是在医学和生物防御学上具有非常重要意义的一类微生物，这几个菌株的全基因组序列也非常相近。但是，研究发现这类微生物所表现出的疾病和宿主之间的特异性往往取决于质粒，当不同菌株所含质粒的大小和数目不同时，其染色体通常会表现出很强的一致性及蛋白质相似性，甚至连基因的差异都很有限[6]。不过，在对这些菌株进行基因组学研究的基础上，通过应用其他基因芯片和蛋白质组学等技术就能对这些菌株的一些功能性进行深入研究。

从干酪、香肠和肉制品中分离出来的三株单核细胞增生李斯特氏菌F2365、F6854和H7858的基因组得以分析，结果表明他们分别含有51、97和69个特异性基因，这些菌株及其不同的特异性基因很可能会对其病原性及其在不同环境中的生存能力产生影响。另外，与菌株F2365相比，菌株H7858和F6854的基因组序列中分别发现8603和105050个高质量的单核甘酸多态性。通过基因组的比较分析发现，三株单核细胞增生李斯特氏菌的基因组在本质上是相互联系的，其差异主要体现在噬菌体插入位点、转座因子和SNPs上[7]。

空肠弯曲杆菌是一种常见于人肠道内的病原菌，具有很明显的菌株-菌株间差异性，这种差异能够直接导致其病原潜力的差异。C.jujuni81-176因其能够表现出独特的病原特征并具有很强毒力而常用于实验室研究，通过该菌株进行基因组学分析，能够找出大量的与其特定代谢性质和病原性质相关的遗传特征，经过鉴定还发现该菌株为获得遗传信息而能够发生整合的不稳定区域[8]。这些研究更加有助于我们理解空肠弯曲杆菌的发病机理，特别是发现一些高致病性菌株所具有的一些独特特征。

1.2 乳中其他致病菌的基因组学研究

金黄色葡萄球菌能够引发乳房感染，严重影响牧群健康和原料乳质量，Leigh等[9]对一株分离于牛乳房炎的Str.uberis进行基因组测序分析，并对该菌株引发疾病的机理方面做了相关验证，如果将上述结果同疾病模型和后基因组学分析相结合就能进一步阐述致病菌与宿主之间的相互作用关系。另外已经引起人们广泛关注的菌株是来源于牛临床分离物的菌株副结核分枝杆菌，因为它能引发牛副结核病（一种发生于牛和其它反刍动物体内的慢性持续性肠炎）。2005年，副结核分枝杆菌菌株K-10的全基因组序列已经完成，经分析其基因组共有4,829,781个碱基，4,350个ORFs，45个tRNA和一个rRNA操纵子[10]，副结核分枝杆菌基因组序列的获得为进一步开展相关蛋白的毒力特性和生理学研究以及新的检测牛副结核病方法的建立奠定了基础。

1.3 乳中腐败菌的基因组学研究

腐败菌也是影响乳制品质量的重要因素之一，如荧光假单胞菌[5]产生的一些蛋白酶和肽酶，往往不能经过一般热处理而失活，在产品货架期间会产生苦味、风味淡薄及其他一些质地缺陷；而能够形成芽孢的菌株，例如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌也是主要潜在腐败微生物，在巴氏杀菌乳中，热处理基本上能够失活所有不能形成芽孢的细菌，但是由于芽孢能够在经过巴氏杀菌后存活并再次萌发同样会对乳品质量带来严重影响。上述这些细菌能够适应多种自然环境，这是有其基因多样性决定的，通过比较基因组杂交法分析发现，这些菌株之间存在非常大的遗传异质性；芯片杂交显示枯草芽孢杆菌的168个特异性基因中有近三分之一能够表现出变异性[11]。

乳中各种病原菌和腐败菌的污染情况与农场、饲料及贮存条件等密切关，这些污染的微生物由于生存环境和所受应激的差异，同种菌株的基因组之间存在着很大的多样性和差异性，但是为了对食品相关细菌进行研究，我们通常选择标准菌株或模式菌株进行研究。所以，目前在乳中污染微生物基因组研究方面存在的一个问题是，乳中存在的天然菌株与实验室保藏的参考菌株在特性上存在许多差异，天然菌株往往具有或不具有很多参考菌株所不具有的一些特性，而这些特性又会直接在其基因组上有所体现。因此，为了更好将基因组学应用于生产实践，我们需要了解更多来源于乳中天然菌株的基因组序列，进而对这些序列进行比较分析，以更好的反映不同菌株特性与基因组之间的联系，为将基因组学应用于乳品生产控制方面奠定基础。

2 基因组学在乳品生产控制上的应用

目前，国内外对临床标本中病原菌和腐败菌的检验大多仍采用所谓的“金标准”——培养法，其缺点是耗时、耗力、耗材。在对乳品生产安全的控制方面，基因组学相关技术具有逐渐取代耗时、准确性差和灵敏度不足的传统培养和形态学试验等方法的趋势，而将乳品微生物检测带入成本更低、速度更快且诊断潜力更强的核酸技术时代。但是，需要注意的一点是，核酸技术在微生物检测中应用的前提是乳品中关键要控制的微生物基因组学的研究深度，另外对该微生物进行菌种鉴定和菌株计数时靶基因的选择也要适当。通常我们对菌株进行鉴定时所选择的靶序列一方面要对同种微生物具有高度保守性（如16SrDNA），另一方面，又要对不同种、亚种微生物具有选择性和靶向特异性。当针对于不同检测目的的靶序列确定后，我们便可以对乳中污染微生物进行定量和定性检测[12]，包括单一菌株分析和群落分析，以及一些毒性基因及抗性基因的检测和细菌在环境应激条件下产生的各种基因突变等。

2.1 乳中细菌鉴定

以DNA为基础的细菌鉴定技术已经发展为很多种，包括实时多聚酶链反应技术、靶基因序列分析、脉冲场凝胶电泳、随机扩增多态性分析、多位点序列分析及基因芯片等。研究发现，生物细胞rDNA分子的一级结构中既具有保守区，又具有可变区。保守的片段反映了生物物种间的亲缘关系，而高变的片段则表明物种间的差异，那些保守的或高变的特征性核苷酸序列则是不同分类级别生物（如科、属、种）鉴定的分子基础。在对乳中细菌进行鉴定时，靶基因一旦确定，对于我们将现有细菌鉴定方法和检测技术结合使用来说是有利的。

MLSA是在多位点酶电泳的理论基础上发展起来的一种分子鉴定方法，该方法最初只用于脑膜炎双球菌的鉴定[13]，随后该方法又成功地鉴定了几种其他的病原菌，如肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌[14]、空肠弯曲杆菌和单核细胞增生李斯特氏菌[13]等。该方法利用自动化的DNA顺序分析对不同管家基因上等位基因的特征进行描述。由于微生物的核甘酸序列之间存在很大的差异性，所获得的结果可以到互联网上相应的文库中进行比对。该方法也适合作为通用的流行病学研究方法。

此外，能对多种不同菌种和特定微生物性状进行快速检测和计算的芯片技术在乳品安全控制上的研究也越来越多，Champion等利用基因芯片对111株空肠弯曲杆菌的全基因组进行比对，再通过基因分型和一些计算方法对其结果进行分析，而获得了这一重要食源致病菌系统分化模型，这在控制该菌所引发的疾病方面具有重要意义，相应方法同样适合其他病原微生物的研究[15]。

2.2 乳中细菌定量

在乳制品或食品的质量安全鉴定方面，快速检测方法的开发是许多研究者所致力追求的目标。核酸诊断技术省去了传统方法中必须进行培养的步骤，而是通过体外扩增DNA技术对食源性致病菌或腐败菌进行定量或鉴定，与传统方法相比，能在更短时间内对食物中单一或复杂的病原菌进行灵敏且特异性的检测[16,17]。另外，分子生物传感器的出现将促进在线生物分析的发展，而利用芯片技术对复杂病原菌菌群进行定量和鉴定也将是未来核酸诊断技术的一个发展方向。聚合酶链反应是目前来说对牛乳中微生物进行检测时检测限最低的一种检测技术，虽然在实际应用PCR技术时仍然会受到一些限制，部分原因在于样品制备上存在难度，因为乳中含量较高的脂肪和蛋白质可能会对PCR扩增起抑制作用，但是其最低检测限仍可以达到一个细胞/mL[16]。美国国家动物健康监护系统在2002年分别利用传统方法、常规PCR和实时定量PCR技术对全美乳样中含有伤寒沙门氏菌的情况进行调查，结果显示，对于从美国21个州854个农场获得的样品，经传统方法检测出的乳样有22个，经常规PCR检测出的乳样有94个，而经实时定量PCR检测出的乳样有100个[18]。与常规PCR相比，实时PCR更不易于污染，并且劳动量更少。鉴于这些原因，实时PCR具有取代常规PCR而成为分子诊断学的常用方法。目前，实时定量PCR已经用于各类病原菌的检测和定量，也用于一些存在于环境中的特定细菌的计数[19]。

尽管目前DNA相关检测技术具有灵敏度高、特异性强等优点，但是由于来源于死细胞的DNA降解速度很慢，容易产生假阳性检测结果[20]。与之相比，RNA在对乳中细菌进行检测和鉴定方面不同于DNA，因为其在微生物死亡以后迅速降解，这样就可以有针对性的只检测大多数有活力的细菌。此外，mRNA和rRNA在数量上要高于基因组DNA，而能进一步降低检测限度。因此，RNA相关技术在对乳中细菌进行检测方面同样具有很强的推广优势。

2.3 抗生素抗性基因的检测与监控

食品企业对原料奶中抗生素残留要求很严格，尤其是对发酵性乳制品来说，抗生素残留所带来的危害是巨大的，因为大多数发酵剂都不具备抗生素抗性。但是，伴随着抗生素在动物饲养业中的频繁使用，促使许多具有腐败特性和毒性的乳品污染微生物都携带了抗生素抗性基因，这对人类健康及医药领域的发展来说是不利的，而且更为严重的是，这些含有抗生素抗性的污染菌不仅自身具有抗生素抗性，并且还能向人胃肠道中其他敏感细菌转移抗生素抗性基因。从目前研究结果来看，美国在这方面的相关报道较多，例如，Murinda等曾对从牛奶场分离物中获得的24株大肠杆菌进行鉴定[21]，研究发现其中10株大肠杆菌具有抗生素抗性，8株大肠杆菌的基因组序列中发现了Ⅰ型整合子，而且有7株大肠杆菌能够对两种或两种以上的抗生素产生抗性；Ray等对分别从传统和正规牛奶场获得的沙门氏菌的抗生素抗性进行评价，研究认为来源于不同牛奶场的沙门氏菌对大多数抗生素而言所表现出的抗性是相似的，但是来自传统牛奶场的沙门氏菌中至少有一株能够同时抵抗五种抗生素[22]。

目前关于食源性病原菌在抗生素抗性基因传播过程中所担当的角色已经成为当前研究的重点，为了鉴定、监控和控制乳品环境中抗生素抗性基因，研究者们希望能够通过发展基因组学技术而产生一些更特异更快速的定量监测方法。Srinivasan等对具有抗生素抗性的19株单核细胞增生李斯特氏菌的基因序列进行分析，分别发现了不同抗生素抗性基因编码的序列[23]，如floR、penA、strA、tetA和sulI，而其他抗生素抗性基因（cmlA，strB，aadA，vanA，vanB，ampC，ermB，ereA和ereB）和剩余部分四环素抗性基因（tetB，tetC，tetD，tetE和tetG）则未能在从牛奶场中分离出来的单核细胞增生李斯特氏菌的基因组中发现；此外，Yu等采用实时定量PCR技术对来源于不同环境样品中的三种四环素抗性基因（tetA、tetC和tetG）进行检测[19]，并对残留于动物粪便中的抗生素抗性基因对环境产生的影响做出趋势判断，这些研究都为今后携带抗生素抗性基因致病菌的定量检测奠定了基础。

3 结果与展望

对于乳品生产来说，致病菌和腐败菌污染是影响原料乳质量的重要因素，对乳原料中微生物进行快速且准确的定量和定性一直都是行业人士的研究重点，此外，关于乳中污染微生物对环境的应激适应情况及对其残存情况的实时监控等方面也与乳品产品质量直接相关。基因组学的发展为我们了解微生物和开发各种新兴的核酸分子检测技术奠定了基础。在基因组学的理论指导下，一些以基因为研究对象，对乳品生产中的微生物进行定量、检测及鉴定技术已经得以开发并应用于生产中，而且相应的研究仍在继续，如，针对多个物种情况进行分析的宏-基因组技术或群落分析，各种致病基因和抗性基因的定位和比较以及结合蛋白质组学对致病菌产生的一些综合性细胞应答方面的研究，当然还要进行一些适合生产实际的、低成本技术的开发，因为基因组序列分析的高成本是限制其深入研究和应用于生产的主要原因。

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