猪繁殖与呼吸综合征疫苗的研究进展

刘灿，宁宜宝，徐镔蕊

（1.中国兽医药品监察所，北京100081；2.中国农业大学动物医学院，北京100193）

猪繁殖与呼吸综合征疫苗的研究进展

刘灿1，2，宁宜宝1∗，徐镔蕊2∗

（1.中国兽医药品监察所，北京100081；2.中国农业大学动物医学院，北京100193）

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的严重危害世界养猪业的一种传染病，该病可造成猪的繁殖障碍、呼吸系统病症与生长受阻。本文着眼于PRRSV疫苗的免疫原性、保护效力和安全性，涉及市场上现有的商品化疫苗与已报道的处于试验阶段的相关疫苗研究成果，以期为PRRSV的防控与疫苗研发提供有益的参考。

猪繁殖与呼吸综合征；疫苗；疫病防控

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的重大动物传染性疾病［1］。从1980年代末在北美被发现至今，该病在世界范围内的流行与数次暴发导致了世界各地养猪业的巨大经济损失。PRRSV属于动脉炎病毒科，为有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组大小约为15 kb，包含至少10个开放阅读框（ORF），依据基因特征分为北美型与欧洲型两个亚型，两型之间的同源性大约为60%［2-4］，并且两种亚型的PRRSV基因序列的进化率的变异率（10-2／位／年）明显高于其它RNA病毒（10-3～-5／位／年），由此带来了更为复杂的疫苗研发难题［5］。

常用的PRRSV疫苗包含灭活疫苗与弱毒疫苗，灭活疫苗的安全性与弱毒疫苗更为优秀的临床效果是两者各自的突出优点，同时灭活疫苗的交叉保护性差和弱毒疫苗的毒力返强与基因重组风险也制约着世界范围内养猪业对PRRSV的防控与将来的净化。此外，日趋成为研究热点的多种基因工程疫苗也逐渐为畜牧兽医从业人员所熟知［6-8］。笔者就目前市场上现有商品化疫苗与国内外疫苗研究进展作一综述。

1 灭活疫苗

PRRSV灭活疫苗具有安全、不返强、不干扰母源抗体和易贮存与运输等优点，其缺点则为单次免疫剂量大，需多次免疫且对异源毒株免疫效果不理想。现有商品化的灭活疫苗在欧洲市场得到了大量应用，包括应用于母猪与仔猪的德国勃林格公司的Ingelvac®PRRS（P120株）疫苗、西班牙海博莱公司的Suipravac-PRRS（5710株）疫苗、法国梅里亚公司的Progressis®疫苗，以及可同时应用于种公猪、母猪与仔猪的捷克Dyntec公司的Suivac PRRS-IN（VD-E1／E2与VD-A1株）疫苗；在美国市场则仅短暂出现过荷兰英特威公司的PRRomiSeTM疫苗；亚洲市场的韩国主要使用其本土企业生产的SuiShot®PRRS疫苗，中国常见的PRRSV灭活疫苗除了几个欧洲品牌之外，还有山东齐鲁生产的PRRSV-SD1灭活疫苗、中牧与广东永顺生产的NVDC-JXA1株灭活疫苗。

Dai等［9］将仙台病毒的包膜蛋白（HVJ-E）作为免疫佐剂加入JXA1-R作为毒种产生的灭活疫苗比无佐剂的灭活疫苗对28日龄仔猪的免疫保护效果更好：HVJ-E为佐剂的灭活疫苗比无佐剂灭活疫苗诱导了更强的淋巴细胞增殖效果、γ干扰素与白介素2（IL-2）上调、白介素10（IL-10）下调以及更高的抗体水平，攻毒后的临床观察表明含HVJ-E佐剂的灭活疫苗能更大程度地减轻仔猪的临床症状。Geldhof等［10］比较了三种欧洲的商品化疫苗和以07V063株、LV株为毒种的两种自制灭活疫苗对抗07V063野毒株时对仔猪的免疫保护效果，发现三种商品化疫苗比两种对照组都可将病毒血症缩短至少1星期，而两种自制灭活疫苗都没有影响病毒血症的持续时间。有趣的是：相较于三种商品化的灭活疫苗与弱毒疫苗，两种自制灭活疫苗诱导动物机体产生了针对07V063的中和抗体。然后，Geldhof等又做了第二个试验，比较了08V194株、LV株与07V064株为毒种的灭活疫苗与商品化弱毒疫苗Porcilis®PRRS对抗08V194野毒株的免疫保护效果，发现LV株、07V064株为毒种的灭活疫苗对病毒血症持续时间无明显影响，针对08V194株的特异性中和抗体在所有免疫的动物体中都有检测到，其中弱毒疫苗诱导机体产生中和抗体的速度更快。综合上述两个试验结果分析，提示当田间流行的变异毒株躲避了现有弱毒疫苗提供的免疫之后，同型的灭活疫苗或许能提供一定的保护。Karniychuk等［11］同样利用PRRSV-07V063株为毒种制备灭活疫苗，在怀孕母猪孕期的第27天、55天与83天依次进行了三次免疫，然后在第90天使用07V063株进行攻毒，结果表明该灭活疫苗不能对母猪与胎猪提供完全保护，但能够轻微地减弱母猪的病毒血症，其中值得注意的是，它能通过减少PRRSV从子宫内膜转移到胎盘的数量以提高胎猪的成活率。Dwivedi等［12］应用可生物降解的纳米颗粒聚乳酸-羟基乙酸共聚物（Poly（D，Llactideco-glycolide），PLGA）包裹的VR2332毒株灭活疫苗滴鼻免疫3到4周龄仔猪后的第21天进行攻毒，发现经纳米颗粒灭活疫苗免疫的仔猪的病毒血症持续时间缩短到两周，肺脏匀浆中γ干扰素上调，转化生长因子-β下调，且肺脏匀浆做中和试验的滴度明显高于对照组与普通灭活疫苗组，表明纳米颗粒PLGA包裹灭活疫苗以滴鼻途径免疫仔猪可以作为有效的免疫途径快速清除病毒血症并对抗PRRSV感染。

2 弱毒疫苗

目前，PRRSV弱毒疫苗在田间应用最为广泛，相较于灭活疫苗具有免疫力强、抗体产生速度快、可体内复制并保持长久免疫效力等优点。1995年，德国勃林格公司开发出首个商品化的用于3到15周龄猪的北美型PRRSV弱毒疫苗Ingelvac®PRRSV MLV（VR-2332株，2005年进入中国市场），该公司后期又研发出应用于仔猪与育肥猪的北美型PRRSV弱毒疫苗Ingelvac®PRRS ATP（JA-142株）。仅应用于欧洲市场的欧洲型PRRSV弱毒疫苗包括美国默克公司的应用于母猪与后备母猪的Porcilis PRRS®（DV株）弱毒疫苗、西班牙海博莱公司的应用于仔猪与育肥猪的Amervac-PRRS®（VP046株）弱毒疫苗与西班牙Syva公司的应用于各阶段猪只的Pyrsvac-183®（All-183株）弱毒疫苗。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所以本土分离毒株CH-1a株为种毒研制的CH-1R弱毒疫苗于2007年正式投产上市。2008年，中国动物疫控中心、哈尔滨兽医研究所与特产研究所分别研制出针对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）的弱毒疫苗JXA1-R株、HUN4-F112株与TJM-F92株，免疫这三种弱毒疫苗的仔猪能很好地抵抗同源与异源毒株的感染［13-15］。2009年，南京农业大学与天津瑞普公司共同研发的R98株弱毒疫苗也被批准为新兽药［16］。中国兽医药品监察所将HP-PRRSV GD株在体外传代致弱，获得GDr180弱毒株在临床试验中表现出优良的免疫效果与安全特性。

Martelli等［17］将Porcilis PRRS®（DV株，欧洲型）弱毒疫苗分别采用肌肉注射与无针头注射器皮内注射的方式免疫了4周龄仔猪，在免疫后第45天将免疫猪与对照猪一起跟有PRRSV感染史（该养殖场内流行PRRSV毒株为欧洲型意大利亚群，与弱毒疫苗DV株同源性为84%）的常规田间饲养的仔猪并圈饲养，观察发现免疫仔猪比对照组仔猪的临床症状减轻了68%～72%，呼吸系统症状减轻了72%～80%，临床保护效果与显著升高的细胞免疫反应密切相关，表明以两种不同方式注射该疫苗都可有效抵抗同源性为84%的异源毒株的感染。此外试验提示在影响疫苗保护效果的因素中，疫苗株诱导细胞免疫的强弱能力比其与田间流行毒株的同源关系远近更重要。Linhares等［18］为了研究弱毒疫苗在田间临床应用时对感染／带毒猪只体内PRRSV病毒的清除能力，设计试验将2000头3周龄仔猪等分到两个独立的猪舍，待仔猪饲养至8周龄时，从两个猪舍中各取100头进行野毒（与北美型MN184毒株同亚群的毒株）接种，接种后第8天与第36天对攻毒-免疫组使用北美型弱毒疫苗Ingelvac®PRRS ATP进行全组的免疫，同时对攻毒-对照组进行盐水注射作为对照，然后选取多个时间点对猪只的血液、唾液、扁桃体与猪舍内气溶胶中的PRRSV核酸进行了定量PCR检测，结果表明两组动物的病毒血症与扁桃体带毒的情况无明显差异，但值得注意的是，攻毒-免疫组相较攻毒-对照组显示出更低的气溶胶带毒量与唾液带毒量。Roca等［19］将3周龄仔猪经欧洲型弱毒疫苗Amervac-PRRS®免疫六周后，使用分离自亚洲的北美型毒株HP-PRRS21株进行滴鼻接毒，发现免疫-接毒组较未免疫-接毒组猪只表现出死亡率低（0／8对2／8）、发热程度轻、卡他性肺炎频率低、增重高（13.4 kg对6.6 kg）与病毒血症轻的特点，表明欧洲型弱毒疫苗能对仔猪提供部分保护效果对抗北美型高致病PRRSV。Nan等［20］发现PRRSVA2MC2株（与VR-2332株及Ingelvac PRRS MLV的碱基同源性为99.8%）接种MARC-145细胞后会造成干扰素-α2蛋白的合成，并能提升干扰素刺激基因ISG15与ISG56的转录水平，然后再将该毒株接种PAM细胞，发现同样能导致上述两个蛋白的上调，并且有少量细胞病变（cytopathic effect，CPE）出现。之后，Wang［21］等将A2MC2毒株、弱毒疫苗Ingelvac®PRRSV MLV、VR-2332株（弱毒疫苗的种毒株）及VR-2385株（中等毒力毒株）分别免疫动物进行了攻毒试验，结果显示A2MC2株较MLV株能更早诱导动物产生中和抗体，并产生更高的中和抗体水平与γ干扰素水平；此外，该毒株免疫动物后可以抵抗同型株或异型株的感染，同时造成与VR2385株类似的病理损伤，说明能以此毒株为基础研发更好的疫苗。Li等［22］将15头猪等分为3组，分别接种HP-PRRSV BB0907株、弱毒疫苗Ingelvac®PRRSV MLV与生理盐水后放入同一猪圈饲养观察，发现接触感染猪在紧急免疫Ingelvac弱毒疫苗后表现出临床发病率低、病毒血症轻、发热与肺部损伤轻以及γ干扰素分泌水平更高的特点，由此推测动物接触感染HP-PRRSV时，紧急免疫弱毒疫苗可以减轻其感染。Geldhof等［23］为了探明现有商品化弱毒疫苗、灭活疫苗与自家灭活疫苗对感染PRRSV流行毒株的母猪的免疫效果，从三个PRRSV病史猪场选取母猪，采用boost免疫策略，分别免疫商品化弱毒疫苗（Porcilis PRRS®与Ingelvac®PRRSV MLV）、灭活疫苗（Progressis®）与自家灭活疫苗（使用3个猪场的流行毒株07V063株、08V194株与08V204株制备）进行促进免疫，然后从临床症状、病毒血症与抗体反应几方面评价各自的免疫效果，结果表明商品化欧洲型弱毒疫苗Porcilis PRRS®与两种自家灭活疫苗搭配免疫显示出促进免疫的效果，而商品化北美型弱毒疫苗Ingelvac®PRRSV MLV与三种自家灭活疫苗都无促进免疫的效果，但是商品化欧洲型灭活疫苗与自家灭活疫苗的促进免疫效果很显著，表明可以将自家灭活疫苗与商品化弱毒疫苗一起免疫以促进母猪的体液免疫效果。Wei等［24］为了阐明HP-PRRSV毒株HBR株在体外传代125代致弱为F125弱毒株的机理，将HBR株的F5代、F10代与F125代毒株分别接种仔猪进行感染试验，同时将3个毒株的基因序列进行了比对分析，结果表明F125代毒株较F5代毒株的毒力明显致弱，F125代毒株较F5代毒株出现了45处氨基酸突变，非结构蛋白与结构蛋白中分别有33个与12个氨基酸发生了突变，且其中15个突变出现在F5传代至F10，剩余30个突变出现在F10传代至F125，推测F10至F125期间的30个氨基酸突变可能与毒力减弱有关，且该HBR-F125株可作为弱毒疫苗的参考株。Ni等［25］利用合成致弱病毒工程（Synthetic Attenuated Virus Engineering，SAVE）技术，使用计算机分析后将PRRSV VR2385株的GP5基因逆优化为一段保持原有功能的改造基因，然后将合成的基因片段插入感染性克隆载体中，拯救出GP5基因被逆优化的病毒SAVE5株，通过动物感染试验证明SAVE5株较原毒株VR2385株对动物造成的病毒血症、临床病变与肺脏的组织病理学损伤有明显减轻，免疫荧光试验、TCID50试验与实时定量PCR试验表明SAVE5株的增殖速度要慢于原毒株VR2385株，所以该研究验证了SAVE技术可用于病毒的快速致弱，且致弱的病毒在体内与体外都表现出了被致弱的相关特征。

嵌合病毒疫苗是弱毒活疫苗中的一种，通常采用已知特性的病毒株（受体株）作为嵌合病毒的骨架结构，然后用具有特异性免疫原性的供体株的基因替换受体株的相关基因。Ellingson等［26］将弱毒疫苗Ingelvac®PRRSV MLV与田间流行毒株MN184株基因组的不同区域进行置换，获得了6个嵌合毒株，通过动物试验证明了其中3株可以像传代致弱的弱毒疫苗一样减轻动物肺脏肉样病变的程度，同时表明只有特定区域置换的嵌合毒株才表现出毒力减弱的特征，并且不能将毒力减弱与病毒的增殖能力减弱简单相关联。Ni等［27］通过DNA重组技术处理多个不同亚群毒株（FL-12株、JXA1株、NADC20株、S132株、VR2430株、VR2385株与MN184B株）的GP5基因与GP5-M基因，然后将重组的GP5基因与GP5-M基因插入感染性克隆载体获取嵌合毒株DS722株与DS5M3株，通过动物免疫攻毒试验发现两株嵌合病毒都显示出了毒力被致弱的特征，比如体内外的增殖能力减弱、病毒血症程度减弱与接种动物病理变化减轻等，其中GP5-M基因被重组的DS5M3株可以有效对抗田间流行PRRSV感染。

3 基因工程疫苗

基因工程疫苗是指使用DNA重组生物技术，把天然的或人工合成的遗传物质定向插入细菌、酵母菌或哺乳动物细胞中，使之充分表达，经纯化后而制得的疫苗，包括标记疫苗、载体疫苗、核酸疫苗与亚单位疫苗等。

标记（Differentiating Infected from Vaccinated Animals，DIVA）疫苗是借助基因工程技术在病毒基因组中引入分子标记，以区别于野毒株的新一代重组活疫苗，使用标记疫苗可有效区分免疫猪与野毒感染猪，对PRRSV的防控与净化有着至关重要的作用。Lima等［28］人工缺失了PRRSV FL12株NSP2基因中的一段B细胞线性表位基因得到特定基因缺失的FLdNSP2／44株，将FL12株与FLdNSP2／44株通过一系列体内外试验证明FLdNSP2／44株仍具有与原代类似的免疫原性、增殖特性与毒力特性，此外，免疫缺失株的仔猪血清被相应表位的ELISA检测为阳性，表明该缺失株可用于鉴别区分免疫猪与野毒感染猪，达到了作为标记疫苗的要求。Lin等［29］在PRRSV毒株vAPRRS株的N蛋白中插入了一段标记基因获得了标记疫苗株v7APMa株，也可稳定用以区分免疫猪与野毒感染猪。Wang等［30］将HP-PRRSV JX143株体外传代100次得到弱毒株JXM100株，将强、弱毒株基因序列比对发现弱毒株的nsp2出现连续的88个氨基酸缺失以及全基因组中分散的75个碱基突变，体内、体外试验发现可以利用JXM100株的88个氨基酸缺失这一特征，将其作为标记疫苗用以鉴别诊断疫苗免疫猪与野毒自然感染猪。

载体疫苗是将编码病原体有效免疫原的基因插入载体基因组中，接种后，随疫苗株在体内的增殖，所需的抗原得以大量表达。杆状病毒是近年来被广泛用于高效表达外源蛋白的载体系统，Wang等［31］、Nam等［32］和Wu等［33］都利用杆状病毒为载体表达PRRSV的GP5与M基因，经过体内外试验，发现新型疫苗与普通核酸疫苗相比在免疫原性上有较大的提升，刺激机体产生γ干扰素的能力与疫苗免疫剂量呈正相关。同样，以GP5和M基因为免疫原基因，Zheng等［34］将牛痘病毒作为载体制备了具有良好体液免疫与细胞免疫反应的新型疫苗。Xu等［35］则成功构建了同时表达PRRSV-GP5蛋白与猪圆环病毒2型（porcine circovirus 2，PCV2）Cap蛋白的杆状病毒。Karuppannan等［36］在普通杆状病毒表达系统的基础上，使用白斑综合症病毒迅速早期1号穿梭启动子，构建了表达PRRSV的ORF2a、ORF3、ORF4与ORF5蛋白的杆状病毒，其在小鼠体内试验中显示了良好的免疫特性。此外，以PRRSV作为载体表达其它病原基因的创意也得到了实践，童武等［37］以弱毒疫苗HuN4-F112株的感染性分子克隆为平台，成功构建了表达猪瘟病毒E2蛋白部分基因的重组毒株。

核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因（DNA或RNA）直接导入动物体细胞内，并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。Zhang等［38］将来自BALB／c小鼠的分子佐剂补体蛋白C3d与PRRSV的GP5蛋白串联后进行真核表达制备了含多重mC3d-p28基因的核酸疫苗pcDNA3.1-C3d-p28.n-GP5，与单独表达GP5的pcDNA3.1-GP5分别接种小鼠后，发现ELISA可检测的特异性GP5抗体、特异性GP5中和抗体、γ干扰素与白介素4在pcDNA3.1-C3dp28.n-GP5免疫小鼠体内都明显高于pcDNA3.1-GP5免疫小鼠，表明该佐剂蛋白可以有效增强抗原的特异免疫反应，具体到本体动物猪身上的免疫效果则有待验证。Du等［39］用VAX载体串联了PRRSV的GP3、GP5、α干扰素和γ干扰素的基因制备核酸疫苗pVAX-α-γ-GP35，进行了短期与长期两种免疫再攻毒的动物试验，发现动物在免疫后第2天攻毒的情况下，该疫苗与pVAX-α-γ一样只能提供部分保护，而当动物在免疫pVAX-α-γ-GP35后第28天经过二免，然后在第56天攻毒的情况下，该疫苗能提供完全的保护，与免疫不含α／γ干扰素的pVAX-GP35核酸疫苗的动物相比，表现为几乎无临床症状、无肺部损伤与明显降低的病毒血症，同时还有显著提高的PRRSV特异性抗体反应、T细胞增殖水平、白介素4和γ干扰素的分泌水平，表明该DNA疫苗可以有效对抗HPPRRSV感染。

亚单位疫苗是指利用微生物的某种表面结构成分（抗原）制成不含有核酸、能诱发机体产生抗体的疫苗。Prieto等［40］将大肠杆菌表达的GP5亚单位疫苗接种仔猪后进行攻毒试验，发现免疫-接毒组比空白-接毒组表现出更严重的呼吸困难与渐进性消瘦等临床症状，表明该亚单位疫苗不仅不能提供免疫保护，反而促进了PRRSV对仔猪的感染，其具体机制仍有待进一步研究。Chen等［41］将热应激蛋白gp96的N端氨基酸位点22-370的基因（Gp96N）作为免疫佐剂与PRRSV的多个B细胞表位基因串联之后制备亚单位疫苗，通过对小鼠与仔猪的接种试验，发现Gp96N可有效提高小鼠／仔猪体内的淋巴细胞增殖反应、小鼠体内的γ干扰素水平、仔猪体内的α肿瘤坏死因子、γ干扰素及白介素12水平，并且白介素4水平降了一半，白介素10水平降至几乎检测不到，由此表明Gp96N可以有效增强多表位亚单位疫苗的先天性／适应性免疫反应。Chen等［42］又将gp96蛋白N端氨基酸22-355位点的基因与PRRSV的B细胞及T细胞表位基因串联后制备亚单位疫苗并免疫仔猪后攻毒（JXwn06株），结果显示该亚单位疫苗能明显减轻仔猪的临床症状。Yang等［43］将PRRSV的ORF1b、ORF7、M与GP5分别融合入以假单胞菌外毒素为基础的载体中成功制备细胞毒性T细胞类型的亚单位疫苗，临床试验显示该亚单位疫苗可有效保护仔猪与母猪对抗PRRSV感染，减轻母猪的临床症状与病毒血症。

4 结语

由于PRRSV的高频率变异特点以及目前对其免疫保护机制的不了解，给高效可靠的疫苗研发带来重重困难，如何克服灭活疫苗的低交叉保护力，降低甚至消除弱毒疫苗返强与重组风险，以及研发安全且具有切实免疫效果的基因工程疫苗，都是亟待解决的问题，随着国内外学者持续升温的研究关注，相信在不久的未来能尽早出现有效控制PRRS甚至能用以将其净化的疫苗。

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（编辑：陈希）

Research Progress of Vaccines against Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome

LIU Can1，2，NING Yi-bao1∗，XU Bin-rui2∗
（1.China Institute of Veterinary Drug Control，Beijing 100081，China；2.China Agricultural University，Beijing 100193，China）

Porcine reproductive and respiratory syndrome（PRRS）is an infectious disease caused by porcine reproductive and respiratory syndrome virus which cause serious damage to the pig industry，infected pigs specifically revealed swine reproductive disorders，respiratory system disease and weight loss.We focuses on immunogenicity and protective efficacy and safety of the vaccines against PRRS，which involved commercialization of the existing vaccine on the market reported and experimental vaccine related research achievements，so as to offer benefit to the prevention and control of PRRSV and vaccine development.

porcine reproductive and respiratory syndrome；vaccine；disease prevention and control

2014-12-24

A

1002-1280（2015）03-0058-07

S852.65

刘灿，博士，从事兽医微生物与兽医病理学研究工作。

宁宜宝，E-mail：ningyibao＠sina.com；徐镔蕊，E-mail：xubr＠sina.com。