血清15型鹅源鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及交叉免疫保护研究

姜安安，王小兰，王少辉，韩先干，丁 铲，王桂军，于圣青

（1. 安徽农业大学，合肥 230036；2. 中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

·研究论文·

血清15型鹅源鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及交叉免疫保护研究

姜安安1,2，王小兰2，王少辉2，韩先干2，丁 铲2，王桂军1，于圣青2

（1. 安徽农业大学，合肥 230036；2. 中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

本研究对安徽省某鹅场急性死亡的雏鹅进行了细菌分离鉴定，无菌采集病死鹅肝脏、脑和心包液，经过培养特性观察、染色镜检、生化特性检测以及16S rRNA和血清学检测，鉴定病原菌为血清15型鸭疫里默氏杆菌，命名为LAG1株。该分离菌株对四环素类药物敏感，而对卡那霉素等耐药；对雏鸭的致病性强，半数致死量（LD50）测定为7.75×103CFU/只；交叉免疫保护试验结果显示LAG1灭活油乳剂疫苗对自身菌株攻毒的免疫保护率可达80%以上，对血清10型鸭疫里默氏杆菌HXb2攻毒的保护率可达70%，对血清1型鸭疫里默氏杆菌WJ4和血清2型鸭疫里默氏杆菌Yb2攻毒的保护率低于20%。本研究结果可为安徽省养鹅业鸭疫里默氏杆菌病的防治工作提供参考。

鸭疫里默氏杆菌；分离；鉴定；鹅

鸭疫里默氏杆菌病又称鸭传染性浆膜炎, 是由鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer, RA)引起的一种侵害雏鸭、雏鹅、雏火鸡等多种禽类的急性或慢性传染病，以气囊炎、心包炎、肝周炎为主要病变[1]。该病最早于1904年由Riemer[2]发现于鹅群中,随后美国学者Hendrikson 和Hibert[3]于1932年在纽约长岛的鸭场中发现并报道了该病的发生。1975 年邝荣禄等首次报道中国广东市存在鸭疫里默氏杆菌病，1982 年郭玉璞等[4]从北京市郊区某鸭场首次分离到RA[4]。此后我国各省市陆续有RA感染的病例报道。

鸭疫里默氏杆菌病的流行无明显的季节性, 一年四季均可发生，但在低温阴雨、潮湿、寒冷的环境更易诱发,主要发生于12～30日龄雏鸭。2013年7月中旬安徽省六安市某鹅场的46日龄雏鹅发病，发病急且发病3 d左右死亡，死亡率约为20%。主要症状为白色或绿色拉稀，脚掌发黄无血色，头颈扭曲震颤等，剖检可见纤维素性心包炎和肝周炎。为了对其病原进行确诊，采集病死雏鹅的心包液、肝脏和脑组织进行了细菌分离和鉴定。

1 材料与方法

1.1 病料来源2013年7月中旬对安徽省六安市某鹅场46日龄病死雏鹅，无菌采集心包液、肝脏和脑组织。

1.2 试验材料兔鲜血培养基、普通琼脂培养基和麦康凯培养基按常规方法自行制备后保存于4℃冰箱备用；细菌生化微量发酵管为杭州微生物试剂有限公司产品；胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤（TSB-YE）、胎牛血清、V-P试剂、MR试剂、吲哚试剂、硝酸盐试剂均购自绍兴天恒生物科技有限公司；2×Taq PCR Master Mix 购自天根生化科技（北京）有限公司；Montanide ISA 71VG购自法国SEPPIC公司。

1.3 细菌的分离培养无菌条件下采取病死雏鹅的心包液、肝脏和脑组织, 分别接种于血琼脂培养基、普通琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基，37℃恒温培养24～48 h后观察细菌的生长。

1.4 细菌形态观察取血琼脂平板上经过纯化的单个菌落, 革兰氏染色镜检。

1.5 生化试验取血琼脂平板上单个菌落分别接种于系列生化反应管和生化培养基中，37℃ 培养24～48 h,观察结果。

1.6 RA 16S rRNA检测使用PCR方法扩增RA的16S rRNA并测序，对病原菌进一步鉴定。挑取分离菌的单个菌落接种TSB培养基培养24 h。吸取1 mL菌液用煮沸法提取细菌DNA，作为扩增模板,使用特异性引物P1（5'- GAGCGGTAGAGTA TCTTCGGATACT-3'）和P2（5'- AATTCCTTTGAG TTTCAACCTTGCG -3'）进行RA 16S rRNA扩增。PCR反应体系（50μL）：灭菌ddH2O 18.5μL、2×Taq PCR Master Mix 25μL、上下游引物P1/P2各2μL、模板2.5μL。PCR反应条件：94℃预变性4 min；94℃变性40 s，50℃退火 40 s，72℃延伸1 min的循环程序进行30次循环；72℃延伸10 min。PCR 反应结束后用琼脂糖凝胶电泳检测结果。将扩增产物送至上海迈浦生物科技有限公司测序，测序后经BLAST进行序列分析。

1.7 血清型鉴定RA血清1型、2型、6型、10型和15型兔抗血清，按照玻片凝集试验方法，采集对分离菌株进行血清型鉴定。上述各型兔抗血清均由中国农业科学院上海兽医研究所畜禽细菌性传染病研究实验室制备并保存。

1.8 药敏试验采用药敏纸片扩散法, 对分离菌株进行药敏试验, 37℃恒温培养24 h观察结果。

1.9 半数致死量（LD50）测定将分离菌株接种到TSB 中，置37℃ 5% CO2培养箱培养至OD600值为1。采用10倍倍比稀释法将菌液计数并稀释至含菌量为107、106、105、104、103CFU/mL，各稀释度分别腿部肌肉接种15日龄樱桃谷鸭 6只，0.5 mL/只。接种后对发病死亡情况连续观察记录 1 周。

1.10 交叉免疫保护性测定灭活LAG1油乳剂疫苗制备：将分离菌株LAG1进行培养、纯度检测及细菌计数。在细菌的对数生长期按体积比加入0.4%福尔马林，37℃、200 r/min振荡15 h进行灭活。灭活后取样接种于TSA平板，37℃、5% CO2静置培养24 h，无菌检验后制备灭活LAG1油乳剂疫苗。取含菌量

为6.7×1010CFU/mL的灭活菌液，按照3:7的比例加入Montanide ISA 71VG，高速搅拌乳化后分装，100 mL/瓶，室温保存。制备好的疫苗接种于TSA平板，37℃、5 % CO2培养箱培养24 h，检查有无细菌生长。

将56只5日龄健康樱桃谷雏鸭平均分成8组，每组7只，其中1～4组为免疫攻毒组，5～8组为非免疫攻毒对照组。对免疫攻毒组的雏鸭采用颈部皮下接种方法进行免疫，免疫剂量为109CFU/0.5 mL/只，2 周后同法加强免疫 1 次。对照组不做任何免疫接种处理。二次免疫14 d后，分别使用血清1型强毒株WJ4、血清2型强毒株Yb2、血清10型强毒株HXb2和自身菌株LAG1对免疫雏鸭组（1～4组中随机选1组）和非免疫雏鸭组（5～8组中随机选1组）进行腿部肌肉注射攻毒，攻毒剂量为10 LD50。具体攻毒菌数分别为：WJ4，5×108CFU/只；HXb2，103CFU/只；Yb2，106CFU/只；LAG1，7.75×104CFU/只。WJ4株、Yb2株和HXb2株由中国农业科学院上海兽医研究所畜禽细菌性传染病研究实验室分离鉴定并保存。

2 结果

2.1 鹅源鸭疫里默氏杆菌的分离与鉴定

2.1.1 培养特性及细菌形态 分离菌株在普通琼脂、麦康凯琼脂培养基上不生长，在血琼脂培养基上可长成直径约为1 mm的菌落, 凸起、湿润、光滑、呈露珠状。革兰氏染色镜检细菌为革兰氏阴性小杆菌，多呈单个散在排列。将该细菌分离株命名为LAG1。

2.1.2 生化特性 LAG1不发酵糖类和醇类，脲酶试验和氧化酶还原试验为阳性，不还原硝酸盐，不液化明胶，V-P试验、MR试验、吲哚试验均为阴性。详细结果见表1。

2.1.3 RA 16S rRNA检测 PCR 扩增获得1条约500 bp的基因片段（图1），测序后用BLAST进行分析。该基因片段与GenBank中已登录的RACH-2（登录号：CP004020.1）、RA-GD（登录号：CP002562.1）、DSM 15868（登录号：CP002346.1）、CH3（登录号：CP006649.1）、RA-CH-1（登录号：CP003787.1）和ATCC 11845（登录号：CP003388.1）菌株的16S rRNA序列同源性高达99%，因此鉴定LAG1分离株为鸭疫里默氏杆菌。

2.1.4 血清型鉴定 血清凝集试验表明LAG1分离株与RA15型兔抗血清呈阳性反应，与RA 1、2、6和10型兔抗血清呈阴性反应， 因此鉴定LAG1为血清15型RA分离株。

2.2 药敏试验 判断标准参考药敏纸片生产商杭州微生物试剂有限公司提供的判断标准：低于中介度为低敏或耐药，高于中介度为高敏，处于中介度范围内为中敏。结果显示分离菌株对β－内酰胺类，四环素类，大环内酯类药物敏感度较高；对氨基糖苷类药物中度敏感；对氯霉素类耐药。药敏试验结果详见表2。

2.3 半数致死量（LD50）测定采用累积法[5]计算LAG1菌株的LD50

累积数中的动物数=本组动物所有数+所有大剂量组存活数+所有小剂量组死亡数

累积数中的死亡数=本组死亡数+所有小剂量组死亡数

1)求死亡率每相差1 %时，剂量差：

（103×103-103）/（60%-20%）= 2.25×104

2)求LD50剂量

LAG1=60%-50%=20%

104-2.25×104×20%=5.5×103CFU/只

即LAG1菌标的LD50=7.75×103CFU/只

经计算LAG1菌株的LD50=2.25×104CFU/只。

2.4 交叉免疫保护试验交叉免疫保护试验结果显示LAG1株对自身菌株的保护率最高为85.7%，其次对血清10型的HXb2株的保护率较好为71.4%，对血清1型 WJ4株和血清2型Yb2株几乎无保护力。详细结果见表4。

3 讨论

从安徽省某鹅场分离的细菌, 通过流行病学、剖检病变、细菌分离培养、染色镜检、生化试验和16S rRNA基因测序鉴定为RA，命名为LAG1。

不同来源的RA，其生化特性不完全相同[6]。通常认为RA不发酵碳水化合物,如糖类,但也有少数菌株可发酵果糖、麦芽糖、葡萄糖等。本研究结果表明LAG1菌株不发酵糖类和醇类，不产生硫化氢,不能利用枸橼酸盐,不能还原硝酸盐，不液化明胶，吲哚试验和甲基红阴性，但是脲酶和触酶试验结果为阳性，这些特性与已报道的RA生化特性十分相似。RA在临床上能引起心包炎、肝周炎，与大肠杆菌的临床病理变化十分相似，但是二者的生化特性相去甚远。通常大肠杆菌可发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、山梨醇等多种糖类和醇类，并且吲哚试验和甲基红试验均为阳性。

鸭疫里默氏杆菌病尚无有效的疫苗用于预防，临床上多使用抗菌药物防治。本研究的药敏试验结果显示，LAG1菌株对β-内酰胺类药物，四环素类

药物，大环内酯类药物高度敏感；对氨基糖苷类药物中度敏感；对氯霉素药物耐药，与蔡秀磊等[7]的报道相符合。对1999～2005年从浙江省分离获得的22株RA进行药敏试验，结果显示对红霉素、四环素、氨苄青霉素敏感，对卡那霉素、青霉素、新霉素、丁胺卡那不敏感。Sun等[8]对103株RA的耐药表型及耐药基因进行检测，发现RA存在β-内酰胺酶 基 因（blaCMY-2、blaTEM、blaSHV、blaDHA blaCTX-M），氨基糖苷类耐药基因（aac(3’)-Ia、aac(3’)-IIc, aac(3’)-IV、aph(2’)-Ib、aph(3’)-II、aph(3’)-IV、aph(3’)-VII、aph(4’)-Ia、aadA1、aadA2、aadB、aac(6’)-Ib、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE、armA、npmA），氯霉 素 和氟苯尼考耐药基因（cat1、cat2、cmlA、cmlB、floR），四环素耐药基因（tet(A)、tet(B)、tet(C)、tet(K)、tet(M)），磺胺类耐药基因（sul1、sul2、sul3）等多种耐药基因，在众多耐药表型中RA对氨基糖苷类药物耐受性最强，这表明在治疗RA感染时正确选择抗生素十分重要。

RA血清型呈多态性，据报道我国境内存在25种血清型[9]。张大丙等[10]对2400多株RA进行分析，认为1、2、6、10 型是我国许多地区主要流行的血清型。RA15型最初由Sandhu &Leister（1991）在美国报道，但其菌株来自于新加坡，在新加坡有较高的分离率[11]，而在其他国家和地区很少发现。中国张大丙等[12]2002年首次分离到了[12]，此后鲜有该血清型菌株的分离报道。

RA的毒力差异很大，即使是相同血清型但不同分离菌株之间仍有非常大的差异。该研究分离获得的血清15型RA LAG1菌株，对雏鸭致病力较强，在104CFU攻毒剂量条件下可出现过半数的死亡。RA各血清型间的交叉保护性较差，通常不能提供有效的保护力。本研究表明以LAG1株制备的灭活油乳剂疫苗在二次免疫14 d后，对1型强毒WJ4、2型强毒Yb2攻击的保护力较差，仅14.2%；而对10型强毒HXb2的攻击可提供71.43%的免疫保护率，略低于对自身菌株LAG1攻毒保护。国内外对RA疫苗都多有研究。Sandhu等[13]针对美国优势血清型流行菌株研制了血清 1、2、5 型 RA三价福尔马林灭活苗；高福等[14]研制了血清1型RA矿物油佐剂灭活疫苗；苏敬良等[15]研制了血清1、2型RA 二价油乳剂灭活疫苗；程安春等[16]研制了血清1、2、4、5型 RA铝胶复合佐剂四价灭活疫苗。但是鉴于RA血清型的多样性，流行情况的复杂性及各血清型之间交叉免疫的缺乏性，且现有的疫苗多针对地区优势血清型研制，对非优势血清型如15型RA保护力不佳。近年来江苏省[17]，福建省[18]，四川省[19]，贵州省[20]等地均有关于雏鹅感染RA的报道，这提示对血清15型等非优势血清型RA的防制应引起水禽养殖业的重视。

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ISOLATION, IDENTIFICATION AND CROSS-PROTECTION OF A GOOSEORIGIN RIEMERELLA ANATIPESTIFER SEROTYPE 15 ISOLATE

JIANG AN-an1,2, WANG Xiao-lan2, WANG Shao-hui2, HAN Xian-gan2, DING Chan2, WANG Gui-jun1, YU Sheng-qing2
(1.Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 2.Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241,China)

The aim of this study was to investigate the pathogen of acute death goose from a goose farm in Anhui Province. One bacterial strain named as LAG1 was isolated and identified as a Riemerella anatipestifer serotype 15 isolate through observation of bacterial culture characteristics, characterization of bacterial biochemical properties, amplif cation of bacterial 16S rRNA and determination of bacterial serotype. Drug sensitivity assay showed that the LAG1 was sensitive to tetracycline, but resistant to kanamycin antibiotics. The isolate was highly pathogenic to ducks, and the median lethal dose (LD50) was determined as 7.75×103colony forming units (CFU) when measured in 12-day-old ducks. Animal protection experiment showed that the ducks immunized with inactivated LAG1 oil-emulsion vaccine could obtain prodection rate of more than 80% from challenges with serotype 15 strain LAG1, and 70% from serotype 10 strain HXb2, and less than 20% from challenges with serotype 1 strain WJ4 and serotype 2 strain Yb2. The challenge doses for strains LAG1, HXb2, WJ4 and Yb2 were all set as 10 LD50. Our result will benef t for the control of R. anatipestifer infection in goose breeding industry in Anhui Province.

Riemerella anatipestifer; isolation; identif cation; goose

S852.612

A

1674-6422（2015）03-0017-07

2015-05-15

国家自然科学基金（31272591）；农业公益性行业科研专项(201303044)

姜安安，女，硕士研究生，预防兽医学专业

王桂军，E-mail: wangguijun@ahau.edu.cn； 于圣青，E-mail: yus@shvri.ac.cn