DC-SIGN真核表达载体的构建及其稳定转染HeLa细胞系的建立

王 欣，谭 磊，陆 凤，徐乐乐，仇旭升，宋翠萍，孙英杰，廖 瑛，茅 翔，詹 媛，王 琰，周恩民，丁 铲

（1.西北农林科技大学动物医学院，杨凌712100；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）

·研究论文·

DC-SIGN真核表达载体的构建及其稳定转染HeLa细胞系的建立

王 欣1,2，谭 磊2，陆 凤2，徐乐乐1，仇旭升2，宋翠萍2，孙英杰2，廖 瑛2，茅 翔2，詹 媛2，王 琰2，周恩民1，丁 铲2

（1.西北农林科技大学动物医学院，杨凌712100；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）

为研究新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）与树突状细胞特异性粘附分子-3-结合非整合素分子（dendritic cell specif c intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin，DC-SIGN） 的 相 互 作 用 对NDV感 染 树 突 状 细 胞（dendritic cell，DC）的影响，本研究拟构建能够稳定表达DC-SIGN蛋白的细胞系，为研究DC-SIGN蛋白与病毒蛋白互作提供基础。以小鼠DCs提取的cDNA为模板，通过PCR方法获得DC-SIGN基因，连入真核表达载体，并命名为pcDNA-DCSIGN，利用LipofectamineTM2000转染HeLa细胞，G418进行药物压力筛选，经RT-PCR和Western blot鉴定，获得了一株可以高效表达DC-SIGN蛋白的HeLa细胞，且经过多次传代后仍然可以稳定表达DC-SIGN，说明该细胞系构建成功。

树突状细胞特异性粘附分子-3-结合非整合素分子；新城疫病毒；树突状细胞；HeLa 细胞

树突状细胞特异性粘附分子-3-结合非整合素 分 子（dendritic cell specific intercellular adhesion molecule-3 grabbing non integrin，DC-SIGN）， 又称CD209，由美国科学家在研究人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）感染机制过程中发现。DC-SIGN主要存在于树突状细胞（dendritic cell，DC）表面，属于C型凝集素受体超家族，为Ⅱ型跨膜蛋白[1]，由胞浆区、跨膜区、铰链区和胞浆外区组成，其中跨膜区含有15个氨基酸残基，主要与DC-SIGN在膜表面的定位有关[2]。DC-SIGN通过依赖Ca2+的碳水化合物识别区域（carbohydrate recognition domain，CRD）形成寡聚体，增强与抗原的结合能力。DC-SIGN主要可以与ICAM-2、ICAM-3等细胞间黏附分子相互作用，介导细胞间的相互作用，且在感染性和炎症性正负免疫调节过程中发挥重要作用[2]。DC-SIGN参与DCs对病原体的识别与摄入，在DCs的黏附调停，迁移，炎症反应，激活初级T细胞，触发免疫反应以及病毒的感染过程中都扮演着关键的角色[3,4]。

近年来，随着对DC-SIGN的研究不断深入，陆续发现了其在黏附、信号转导、抗原摄取方面的作用。目前研究已发现多种病原微生物，如HIV-1、真菌、埃博拉病毒、登革热病毒、SARS冠状病毒的免疫抑制或免疫逃逸都与DC-SIGN有关[5-7]。本实验室前期在研究新城疫病毒（Newcastle virus disease，NDV）感染DCs引起淋巴细胞增殖发生抑制的过程中，发现NDV感染DCs可能受到DCSIGN蛋白的调节作用，进而影响NDV感染DCs的效力。本研究拟构建能够稳定表达DC-SIGN蛋白的细胞系，为研究DC-SIGN蛋白与NDV病毒蛋白互作提供基础。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂实验动物C57BL/6小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司；HeLa细胞和真核表达载体pcDNA3.1(-)/myc-His为本实验室保存；RPMI 1640培养基、PBS购自Hyclone公司； Fetal bovine serum购自Gibco公司；GM-CSF、IL-4购

自eBioscience公司；转染用质粒小量提取试剂盒购自QIAGEN公司；LipofectamineTM2000和G418购自life technologies公司；T4 DNA连接酶、DNA限制性内切酶XhoⅠ、NheⅠ购自TaKaRa公司；小鼠抗DC-SIGN抗体和山羊抗小鼠IgG抗体均购自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据GenBank中的DC-SIGN的基因序列，用软件Primer 5.0设计了相应的引物。上 游 引 物：5'- GCGCTAGCGCCACCATGAGT G A T T C T A A G G A A A T G G G G A-3'；下游引物：5'- GCGCTAGCGCCACCATGAGT，GATTCTAAGGAAATGGGGA-3'。其中在上游引物添加了NheⅠ酶切位点及保护碱基，在下游引物添加了XhoⅠ酶切位点和保护碱基。

1.2.2 分离和培养小鼠骨髓源树突状细胞 无菌条件下取小鼠的胫骨和股骨，用含1%双抗的PBS吹洗骨髓直至髓腔发白，收集液用40目细胞筛过滤，300×g 离心8～10 min；弃上清，用6 mL红细胞裂解液重悬沉淀，37℃放置3 min后补加PBS上下颠倒混匀，300×g 离心10 min；弃上清，沉淀PBS重悬，300×g离心10 min洗涤1次；弃上清，收集沉淀，并用1 mL含10% FBS、1%双抗的RPMI 1640完全培养基重悬细胞并计数。将分离得到的骨髓细胞接种于12孔细胞培养板中，每孔加1 mL含有GM-CSF（10 ng/mL）和IL-4（10 ng /mL）的RPMI 1640完全培养基，细胞终浓度为2×106个/ mL，然后置37℃、5% CO2的培养箱中培养，培养至d3和d5时，半量换液1次，同时补充GM-CSF和IL-4。

1.2.3 DC-SIGN分子克隆 将培养7 d的DCs从12孔细胞板中吹下来，300×g离心10 min，弃上清，1 mL Trizol 重悬沉淀，室温放置5 min，每1 mL Trizol液加入200 μL氯仿，剧烈震荡15 s，10 800×g、4℃离心5min，弃上清，按每1 mL Trizol 液加500 μL的比例加入异丙醇，－20℃放置30 min，10 800×g离心10 min，弃上清，加入70%乙醇1 mL，混匀后4℃，10 800×g离心5 min，弃

上清，干燥3～5 min，最后用30～50 μL DEPC水溶解沉淀。反转录体系：RNA模板30 μL、随机引物1 μL、DEPC水6 μL、10 mmol/L dNTP 1μL、5×M-MLV buffer 10 μL，在70℃水浴中加热10 min后迅速放置在冰浴上冷却，加入RNA酶抑制剂1 μL、反转录酶1 μL（反转录体系为50 μL），在37℃反应2 h后置于75℃反应5 min，合成的cDNA于-80℃保存备用。

PCR反应体系为50 μL，其中模板DC-SIGN 1 μL、上下引物各1 μL、2×PCR mix 25 μL、灭菌ddH2O 22 μL，反应程序为：94℃预变性 1 min；94℃变性40 s，55℃退火30 s，72℃延伸 45 s，30个循环后；72℃延伸7 min。

1.2.4 DC-SIGN重组载体的构建与鉴定 PCR产物通过琼脂糖凝胶回收大小为717 bp左右的条带，连接pGEM-T easy载体，NheⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到同样酶切位点的真核表达载体pcDNA3.1(-)/myc-His，转化DH5α，挑取单个阳性菌落扩增后进行质粒提取，双酶切鉴定，将鉴定为阳性的质粒送上海生工公司测序，正确序列命名为pcDNA-DCSIGN。

1.2.5 细胞转染及筛选 将长满单层的HeLa细胞以3×105个/孔接种于6孔板中，用含10% FBS的DMEM培养基在细胞培养箱中培养，待细胞长满至60%时，按转染试剂LipofectamineTM2000说明书转染构建好的pcDNA-DC-SIGN载体，同时设未加药物组和空白对照组。根据预实验结果确定G418最佳药物筛选浓度为800 mg/L，转染24 h后开始加入药物，约7 d后，细胞开始出现大量死亡，此时开始隔天换液。当存活细胞形成小簇时，将其消化，经有限稀释法传代至96孔板中，进行阳性克隆细胞的筛选，此时G418浓度仍为800 mg/L[8]。将生长良好的单细胞克隆传代至24孔板, 当细胞生长良好时，再将细胞传代至6孔板，逐步扩大培养，继续加压培养传代1个月, 经2次冻存复苏，期间对阳性克隆细胞进行DC-SIGN蛋白表达情况的检测。

1.2.6 Western blot鉴定DC-SIN蛋白表达 将筛选获得的稳定表达DC-SIGN的HeLa细胞上清吸弃，收集细胞，常规方法处理细胞样品，进行SDS-PAGE电泳，80 V恒压电泳150 min，电泳后将凝胶取出，250 mA恒流转印90 min。转印好的NC膜置于含5%脱脂乳的TBST中4℃封闭1 h，TBST漂洗3次，每次10 min；加入1:1000的Anti-DC-SIGN antibody一抗，4℃作用过夜；再加入辣根过氧化物酶标羊抗鼠二抗（1: 8000稀释），作用1 h， ECL增强显色试剂盒显色。将NC膜用一抗二抗去除液处理后，重新封闭，以小鼠β-actin抗体为一抗（1:5000稀释）和HRP标记羊抗小鼠二抗（1:8000稀释）重新孵育，ECL增强试剂盒显色，Western blot分析β-actin蛋白。

2 结果

2.1 RT-PCR扩增DC-SIGN基因片段结果PCR扩增DC-SIGN目的片段，通过琼脂糖凝胶电泳分析，获得大小约717 bp的明亮条带，与预期大小一致（图1）。

2.2 DC-SIGN重组质粒双酶切鉴定及测序结果将构建好的重组质粒pcDNA-DC-SIGN，经NheⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后，能切下清晰的717 bp大小的目的条带，如图2。同时，将测序结果与预测序列对比，与原序列同源性100%，表明成功构建pcDNA-DCSIGN真核表达质粒。

2.3 RT-PCR检测稳定转染HeLa细胞中DC-SIGN经RT-PCR检测，在成功转染DC-SIGN基因的HeLa细胞中扩增到717 bp的特异性条带。

2.4 Western blot检测稳定转染HeLa细胞DC-SIGN蛋白表达结果Western blot检测DC-SIGN蛋白在HeLa细胞中的表达情况，结果显示DC-SIGN在HeLa细胞系中成功表达，同时，在未转染的HeLa细胞中不表达；细胞内参蛋白β-actin在两组细胞中均有表达，说明稳定转染DC-SIGN细胞系构建成功。

3 讨论

已有的研究结果显示，DC-SIGN与病原体结合后对DCs细胞功能的影响，决定了病原体侵入动物体的最终结局[2]，因而定向研究DC-SIGN与感染性疾病的关系，可以帮助我们从免疫水平找到治疗和预防病原体的有效途径。新城疫病毒（NDV）是副粘病毒科（paramyxoviridae）、副粘病毒亚科（paramyxovirinae）、腮腺炎病毒属（rubulavirus）的一种单股负链RNA病毒，编码核衣壳蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神经氨酸酶蛋白（HN）及大蛋白（L）6种结构蛋白，其中HN蛋白和F蛋白与病毒的毒力和致病性密切相关。ND主要引起侵害禽类的呼吸系统和神经系统，每年给全世界养禽业带来了巨大的经济损失。现有的研究发现NDV可能通过感染DCs，使T淋巴细胞增殖抑制，从而使机体产生免疫抑制的效果[10]，目前对于其具体作用机理还不清楚。

我们在前期研究中发现，由于DC-SIGN的CRD可以识别糖蛋白的N-link糖基化位点，而NDV的HN蛋白在119、341、433、481位氨基酸可以发生N-糖基化，因此推测NDV感染DCs可能是依赖与DC-SIGN的相互作用。为了进一步确证这种推断，本研究构建了pcDNA-DC-SIGN真核表达载体，并转染至HeLa细胞，通过G418加压筛选及有限稀释法获得了稳定表达DC-SIGN分子的细

胞系。经PCR和Western blot方法验证，该细胞系能够正确并且稳定表达DC-SIGN蛋白，反复冻存和复苏以及连续传代培养数代后的细胞仍然能够稳定表达DC-SIGN蛋白，说明细胞系构建成功，这为后续研究NDV病毒蛋白与DC-SIGN的相互作用奠定了基础，进而为研制预防NDV疫苗提供新的方法和思路。

[1] Geijtenbeek T B,Torensma R,van Bliet S J, et al. Identification of DC-SIGN, a novel dendritic cellspecif e ICAM-3 receptor that supports primary immune responses[J]. Cell, 2000, 100(5): 575-585

[2] 刘旭东, 李刚. DC-SIGN与病原体感染的研究进展[J]. 国际内科学杂志, 2007, 34(10): 605-608

[3] Soilleux E J, Morris L S, Leslie G, et al. Constitutive and induced expression of DC-SIGN on dendritic cell and macrophage subpopulations in situ and in vitro[J]. J LeukocBiol, 2002, 71(3): 445-457

[4] Montoya M C, Sancho D, Bonello G, et al. Role of ICAM-3 in the initial interaction of T lymphocytes and APCs[J]. Nat Immunol, 2002, 3(2): 159-168.

[5] Ehlers S. DC-SIGN and mannosylated surface structures of Mycobacterium tuberculosis: a deceptive liaison[J]. Eur J Cell Biol, 2010, 89(1): 95-101.

[6] Halary F, Amara A, Lortat-Jacob H, et al. Human cytomegalovirus binding to DC-SIGN is required for dendritic cell infection and target cell trans-infection[J]. Immunity, 2002, 17(5): 653-664.

[7] Alvarez C P, Lasala F, Carrillo J, et al. C-type lectins DC-SIGN and L-SIGN mediate cellular entry by Ebola virus in cis and in trans[J]. J Virol, 2002, 76 (13): 6841-6844.

[8] Kudo S, Matsuno K, Ezaki T, et al. A novel migration pathway for rat dendritic cells from the blood: hepatic sinusoids-lymph translocation[J]. J Exp Med, 1997, 185(4): 777-784.

[9] 王宇, 阎瑾琦, 张亮, 等. DC-SIGN真核表达载体的构建及其稳定转染BHK21细胞系的建立[J]. 解放军医学杂志, 2010, 35(3): 304-306.

[10] Wills-Karp M. Allergen-specific pattern recognition receptor pathways[J]. Curr Opin Immunol, 2010, 22(6): 777-782.

CONSTRUCTION OF EUKARYOTIC EXPRESSION VECTOR AND ESTABLISHMENT OF HELA CELL LINE WITH STABLE EXPRESSION OF DC - SIGN

WANG Xin1,2, TAN Lei2, LU Feng2, XU Le-le1, QIU Xu-sheng2, SONG Cui-ping2, SUN Ying-jie2, LIAO Ying2, MAO Xiang2, ZHAN Yuan2, WANG Yan2, ZHOU En-min1, DING Chan2
(1.College of Veterinary Medicine, Northwest A&F University,Yangling 712100,China; 2.Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241,China)

To investigate the inf uence of the interaction between Newcastle diseases virus (NDV) protein with dendritic cells specif c adhesion molecules - 3 - grabbing non-integrin (DC-SIGN) on NDV infection of dendritic cell (DC), we generated a Hela cell line stably expressing DC - SIGN protein for studying DC - SIGN protein and virus protein interactions. The cDNA was extracted from mouse DCs and used as template. The DC - SIGN gene was amplif ed in polymerase chain reaction (PCR) for construction of eukaryotic expression vector pcDNA-DC-SIGN, which was then transfected into HeLa cells using LipofectamineTM2000. A HeLa cell line eff ciently expressing DC - SIGN protein was identif ed through RT-PCR and Western blot, and the specif c Hela cell line was stable after many passages.

DC-SIGN; Newcastle diseases virus; dendritic cells; HeLa cells

S852.659.5

A

1674-6422（2015）03-0012-05

2015-03-20

国家自然基金青年基金（31402182）

王欣，女，硕士研究生，预防兽医学专业

周恩民，E-mail：zhouem@nwsuaf.edu.cn；丁铲, E-mail：shoveldeen@shvri.ac.cn