伪狂犬病毒实时荧光定量PCR方法的建立

田 青，郑 浩，童 武，刘 飞，梁 超，曹艳云，郑旭晨，童光志，李国新

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）

·研究论文·

伪狂犬病毒实时荧光定量PCR方法的建立

田 青，郑 浩，童 武，刘 飞，梁 超，曹艳云，郑旭晨，童光志，李国新

根据伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，RV）gB基因保守序列，设计合成一套特异引物和TaqMan探针，建立了一种快速、敏感和特异的检测伪狂犬病毒的实时荧光定量PCR方法。该方法可检测到相当于10 copies/μL的病毒DNA，比常规PCR检测方法高约100倍，敏感性较强；该方法检验猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型呈现阴性结果，特异性强；变异系数小于1%，具有良好的重复性。本研究建立的实时荧光定量PCR方法为临床上对伪狂犬病毒的检测和定量奠定了坚实基础。

伪狂犬病毒；gB基因；荧光定量PCR

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）

伪狂犬病是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus, PRV）感染家畜或野生动物引起的一种以发热、奇痒、呼吸和神经系统症状为特征的急性传染病[1,2]。猪是唯一的自然宿主，是病毒的长期贮存和排出者，在伪狂犬病的传播中起着重要的作用[3]。该病毒可感染各个年龄段的猪，主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎，哺乳仔猪高死亡率及种猪不育。成年猪感染PRV后多呈隐性感染，但可长期携带病毒。出

现临床症状的耐过猪也能成为病毒的携带者，成为传染源，从而增加PRV的防治难度[4]。随着规模化养猪的不断发展和强毒株的出现，猪群中不断增大的养殖压力给PRV的传播提供了理想的条件，使得伪狂犬病的发生和流行日趋严重，现在已有40多个国家报道40多种动物感染PRV[3]。我国已有24个省市报道发生伪狂犬病[5]。自2011年以来，我国很多伪狂犬疫苗免疫猪场爆发了一种疑似伪狂犬的疫病，母猪产弱仔、死胎或流产，仔猪出现神经症状及死亡等[6]。研究证实该疫病由PRV变异株引起，给我国养猪业造成了巨大的经济损失[7-10]。

实时荧光定量PCR将常规PCR与荧光检测技术相结合，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点[11]，并且操作简便，用时短，污染少，通过分析软件可自动定量分析，结果更为准确直观，适用于大批量的病毒定性和定量的检测，已逐渐成为病原体检测的重要方法[12]。

gB是猪PRV的重要囊膜蛋白之一，是疱疹病毒中具有高度保守性的蛋白[13]，在病毒入侵和细胞间传播过程中不可或缺，主要促进细胞膜与病毒囊膜融合，并能够诱导机体产生中和抗体[14]。本研究选择PRV经典株和新出现的变异株gB基因均保守的区域为靶序列，设计并合成一套引物和探针，建立了一种实时荧光定量PCR检测方法。该方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点，为伪狂犬病毒的诊断和研究提供了一种简便、快速、高效的检测方法。

1 材料和方法

1.1 病毒和细胞伪狂犬病毒SC株是早年分离的强毒株[15]；伪狂犬病毒JS-2012株是2012年分离的变异株[8]；猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、猪圆环病毒2型（Porcine circovirus virus type 2，PCV2）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）HuN4株、Vero细胞等均由本研究室保存。

1.2 试剂和仪器质粒提取试剂盒QIAprep Spin Miniprep Kit、RNA提取试剂盒QIAamp Viral RNA Mini Kit购自QIAGEN公司；DNA凝胶回收试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司；反转录试剂盒 PrimeScript RT Master Mix、pMD18-T Vector Cloning Kit、LA Taq with GC Buffer、Premix Ex Taq、dNTP、DNA Marker均购自TaKaRa公司；DNA提取试剂盒TIANamp Virus DNA/RNA Kit、感受态细胞TOP10购自天根生化科技(北京)有限公司；胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培养基均购自Gibco公司；Mastercycler ep realplex荧光定量PCR仪为Eppendorf公司产品。

1.3 样品处理及核酸提取采集的血液室温静置析出血清后，1500×g离心10 min，收集血清。鼻拭子和肛拭子均分别加入1000 μL PBS，涡旋振荡15 s后，8600×g离心1 min，收集上清。病毒DNA的提取按照DNA提取试剂盒TIANamp Virus DNA/ RNA Kit说明书操作，最后使用60 μL的去离子水溶解，-20℃保存。

1.4 引物和探针的设计参照GenBank中PRV gB基因的序列（登录号：JF797217、JF797218、JF797219、JQ809328、JQ809329、JQ809330、KC981239和NC006151）以及由本研究室分离保存的变异株JS-2012的gB基因序列，利用DNAStar Lasergene v7.1软件进行同源性分析，找出gB基因的保守区，利用Beacon Designer 7软件设计出一套特异引物和TaqMan探针。上游引物gB-F：5'-ACCTTGTGGTTGTTG-3'；下游引物gB-R：5'-CATCTACTACAAGAACG-3'；探针gB-Probe：FAM-5'-AGACGCACTTGCCG-3'-BHQ1。探针的5'端选择FAM作为报告基团，3'端选择BHQ1为淬灭基团，扩增目的片段长度为180 bp。引物及探针由大连宝生物工程有限公司合成。

1.5 阳性标准品的制备使用上述gB上、下游引物，以PRV DNA为模板进行常规PCR扩增。反应体系（50 μL）：2×GC Buffer II 25 μL、2.5 mmol/L dNTP Mixture 8 μL、上下游引物（10 pmol/μL）各1 μL、DNA模板2 μL、灭菌ddH2O 12.5 μL、LATaq（5U/L）0.5 μL。反应条件：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，

35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。2%琼脂糖凝胶电泳检测并回收扩增产物，产物回收后连接至pMD18-T载体，将重组质粒转化到TOP10感受态细胞内。使用含Amp的LB平板进行筛选，挑菌培养后提取重组质粒DNA，进行PCR鉴定。对PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序，将测序正确的质粒测定浓度，根据阿伏加德罗常数将浓度换算为拷贝数，10倍系列稀释于-20℃保存。

1.6 反应条件的优化矩阵法优化引物和探针的浓度，将引物和探针浓度分别稀释至0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 pmol/μL，并将退火温度在56℃～58℃范围内以1℃为间距递增进行配比筛选，以获得最低的Ct值和相对较高的荧光增加值，从而确定荧光定量PCR反应的最优条件。

1.7 特异性、敏感性和重复性试验使用本试验建立的荧光定量PCR方法对猪伪狂犬病毒（PRV JS-2012株和SC株）、猪瘟病毒（CSFV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV HuN4株）的DNA或cDNA进行检测，以验证该检测方法的特异性；对10倍系列稀释的阳性标准品进行检测直至该方法不能检出，并同时与常规PCR方法（方法1.5）的检测结果进行比较，以验证该检测方法的敏感性；对5个不同浓度的阳性标准品重复检测4次，统计同一浓度阳性标准品不同重复的Ct值，并计算其标准差及变异系数，以验证该检测方法的重复性。

1.8 临床样品检测分别采集8头PRV感染猪的鼻拭子、肛拭子、血清共24份样品，使用建立的荧光定量PCR对其进行检测，并同时与常规PCR方法（方法1.5）进行比较。

2 结果

2.1 阳性标准品的制备以gB-F、gB-R为引物，阳性PRV DNA为模板扩增的PCR产物约为180 bp，与预期大小一致。PCR产物回收后连接pMD18-T载体，将重组质粒转化到TOP10感受态细胞内。在含有Amp的LB平板上可见大量菌落生长，挑菌培养后提取重组质粒DNA，进行PCR鉴定。将PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序，测序结果与目的片段序列完全一致。测定重组质粒浓度后换算成拷贝数为4.7×1010copies/μL，进行10倍系列稀释后于-20℃保存。

2.2 反应条件的优化通过对不同浓度探针和引物的组合，经过多次重复后，结果显示当探针浓度为0.2 pmol/μL，引物浓度为0.3 pmol/μL且退火温度为60℃时，能够获得最低的Ct值和相对较高的荧光增加值。此时，反应体系（20 μL）：Premix Ex Taq10 μL、上下游引物（10 pmol/μL）各0.6 μL、探针（10 pmol/μL）0.4 μL、DNA模板2 μL、灭菌ddH2O 6.4 μL。反应条件：95 ℃预变性1 min；95 ℃变性 5 s，60 ℃退火30 s，40个循环。

2.3 特异性试验使用优化好的反应体系和条件对本研究室保存的PRV（JS-2012株和SC株）、CSFV、PCV2、PRRSV（HuN4株）同时进行荧光定量PCR检测，结果显示只有PRV呈阳性，CSFV、PCV2、PRRSV均无典型扩增曲线，无模板阴性对照也未出现扩增（图1）。

2.4 敏感性试验使用优化好的反应体系和条件对10倍系列稀释的阳性标准品进行检测直至不能检出，结果显示当阳性标准品浓度为10 copies/μL时Ct值仍在38以内，即本试验建立的荧光定量PCR检测方法最低能够检测到10 copies/μL的病毒（图2）。通过与常规PCR方法进行比较，荧光定量PCR灵敏度比常规PCR高约100倍。

2.5 重复性试验使用优化好的反应体系和条件对4.7×103～4.7×107copies/μL的5个不同浓度的阳性标准品重复检测4次，比较同一浓度不同重复的Ct值，并计算其标准差及变异系数。结果显示，同一浓度不同重复的Ct值标准差为0.02～0.2，变异系数为0.08%～0.66%，说明本研究建立的荧光定量PCR具有很好的重复性和稳定性。

2.6 临床样品检测使用建立的荧光定量PCR和常规PCR对PRV变异株感染猪的临床样品同时进行检测。在24份样品中，普通PCR检出7份阳性样品，荧光定量PCR不仅检出普通PCR检测为阳性的样品，而且检出5份普通PCR检测为阴性的样品，显

示出很好的灵敏度（表1）。

3 讨论

随着规模化养猪的不断发展以及新流行毒株变异株的出现，PRV的发生和流行日趋严重，不断危害着我国的养猪业，给养猪业造成了巨大的经济损失。目前，我国很多规模化猪场的PRV野毒呈阳性，很多中小规模的猪场和小养殖场感染情况更为糟糕，这样使得本病的控制变得更加复杂。伪狂犬病的防控需要综合措施，对于健康猪场应严格做好规范引种，保护易感猪群，封闭化管理，健全规章制度等工作；对于发病猪场，发病动物应及时隔离、治疗和淘汰，未发病动物应采取紧急免疫接种措施，还要加强消毒措施和改善饲养管理。其中，对PRV进行快速、准确的诊断，尤其是对目前较为流行的猪PRV变异株的诊断是及其重要的。

实时荧光定量PCR主要分为SYBR荧光染料法和TaqMan荧光探针法，后者具有更好的特异性[16]。因此，本试验采用TaqMan探针法荧光定量PCR技术建立了PRV的快速检测技术。PRV基因组为双股线性DNA，约为150 kb，含有至少70个基因。我们选取疱疹病毒成员中最为保守的糖蛋白基因gB基因作为检测的靶基因，通过序列的比对，选择了PRV经典株和变异株均保守的区域来设计探针和引物。此外，由于PRV基因组GC含量高达73%以上，导致整个基因结构复杂，局部的二级结构经常影响PCR扩增，同时也增加了引物和探针的设计难度。为了避免这个问题，我们在gB基因的保守区域设计探针和引物时，尽量保障它们有相近的GC和AT含量。通过优化反应条件，建立了一种可定量检测猪PRV的实时荧光定量PCR检测方法，经验证该方法特异性强、敏感性高、重复性好，并且检测时间短、速度快。因此，本试验建立的实时荧光定量PCR检测方法可用于PRV经典毒株或变异毒株的检测和定量。

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DEVELOPMENT OF REAL-TIME FLURESCENCE QUANTITATIVE PCR FOR DETECTION OF PSEUDORABIES VIRUS

TIAN Qing, ZHENG Hao, TONG Wu, LIU Fei, LIANG Chao, CAO Yan-yun, ZHENG Xu-chen, TONG Guang-zhi, LI Guo-xin
(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241,China)

Real-time f uorescence quantitative PCR (qPCR) assay was developed using a pair of primers and a TaqMan probe that were designed according to the sequences of the gB gene of Pseudorabies virus (PRV). This qPCR assay allowed for rapid, sensitive and specif c detection of PRV DNA. The detection limit was as low as 10 copies/μL viral DNA, which was 100 times more sensitive than the conventional PCR. There was no cross-reactivity with other related viruses, such as Classical swine fever virus (CSFV), Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and Porcine circovirus type 2 (PCV2), indicating that the assay was highly specif c to PRV. The distributions with a coeff cient of variation to be less than 1% showed that the assay had good reproducibility. Therefore, the qPCR assay was a valuable tool for rapid detection and quantif cation of PRV.

Pseudorabies virus; gB gene; real-time PCR

S852.659.5

A

1674-6422（2015）03-0001-06

2015-03-20

上海市自然科学基金项目（142R1448900）；上海市科技农重点攻关项目（沪农科攻字（2015）第1-7号）；公益性·行业（农业）科研专项（201203039）；中央科研究院所公益性基础科研业务费项目（2012JB02）；国家生猪现代产业技术体系项目（CARS-36）

田青，男，硕士研究生，预防兽医学专业

李国新，E-mail: guoxinli@shvri.ac.cn