香烟作用于肺部原代细胞影响慢阻肺气道重构的研究进展

陈 玲 蒋雪梅 邓林红

(重庆大学生物工程学院生物流变科学与技术教育部重点实验室，重庆 400030)

香烟作用于肺部原代细胞影响慢阻肺气道重构的研究进展

陈 玲 蒋雪梅 邓林红1

(重庆大学生物工程学院生物流变科学与技术教育部重点实验室，重庆 400030)

慢性阻塞性肺疾病;肺部原代细胞;气道重构

慢性阻塞性肺疾病(COPD)的主要病理改变发生在呼吸道、肺实质以及肺部血管〔1〕。在细胞水平下研究COPD的病理机制既可以采用永生化的细胞株，也可以采用原代细胞体外培养模型，但原代细胞直接来源于机体组织，生物性状尚未发生大的变化，在一定程度上能够更好地反映体内的状态和功能。因此，原代细胞体外培养模型逐渐称为研究包括COPD在内的疾病的病理机制的重要实验对象。本文拟分析和总结香烟刺激对COPD气道重构的影响。

1 肺部原代细胞

1.1 肺部原代细胞的来源 肺移植、肺切除、肺组织活检以及肺泡灌洗是获取肺部原代细胞的主要途径，再通过直接解剖分离，流式细胞分选术或探针标记法可进一步获取纯度较高的目标原代细胞。这些原代细胞主要包括上皮细胞、内皮细胞、气道平滑肌细胞、成纤维细胞、Ⅱ型肺泡细胞、巨噬细胞以及白细胞〔2〕。

1.2 肺部原代细胞对研究COPD病理机制的重要性 过去在COPD的研究中，主要采用多种细胞株作为实验对象，如Ⅱ型肺泡细胞(A549)以及上皮细胞(BEAS-2b,HBE1,16HBE140)〔3〕，但是研究人员一直对使用细胞株探究发展性疾病的准确性持怀疑态度。因而，原代细胞体外培养模型在发展性疾病病理机制的研究中受到越来越多的重视。原代细胞因刚从组织或机体中分离，其生物学特性尚未发生很大变化，仍保留着原来的遗传特性，也最接近和反映体内生长特征，因此原代细胞体外培养模型为研究COPD提供了更好的选择，已经成为至关重要实验模型。原代细胞最能直接地反映COPD患者和非患者对不同有害刺激或药物刺激的反应，有助于更准确地从细胞分子学层面上揭示疾病的发生发展过程，解释疾病的病理机制。此外，使用原代细胞体外培养模型也是研究新的治疗靶点和新的治疗方法的重要手段，可真实地检验新药物的药理学效力和作用机制。

原代细胞从组织或机体中分离之后进行体外培养，虽然方便科研人员研究细胞对不同刺激的反应，但不足之处是细胞脱离原位组织结构之后被放在简单单一的环境中进行培养，细胞失去了与体内细胞外基质(ECM)，炎症因子以及其他形态细胞的相互作用。长时间这样环境中培养的原代细胞也会逐渐产生表型变化。为避免这样的变化影响实验观察结果，科研人员需在有限的细胞代数之内使用原代细胞进行实验，并时刻监控着原代细胞的细胞形态变化。

2 香烟烟雾刺激与COPD病理模型

2.1 香烟烟雾诱导COPD的主要病理模型 香烟烟雾被公认为诱导COPD的高危因子〔4〕，其对气道的危害涉及气道损伤，气道炎症和气道重构。在研究香烟烟雾诱发COPD的病理改变和发病机制时，动物模型和肺部细胞体外培养模型都被广泛使用。作为在体模型，使用香烟烟雾刺激所制作的COPD动物模型最接近人肺部实际的病理变化。采用这类动物模型探究COPD的发病机制和药物治疗方法的报道文献很多，可参加本文所列参考综述文献〔5〕。而使用香烟烟雾提取物(CSE)刺激COPD原代细胞则是探索COPD发展的最常用的体外培养模型之一，也是以下着重介绍的研究内容。

2.2 实验用CSE的制备和特点 香烟烟雾进入人体呼吸道之后，部分小体积的微粒可以抵达肺泡，然而很多微粒沉积在上呼吸道或大气道〔6〕。香烟烟雾是一种成分复杂的刺激物，含有4 000多种不同的化学成分，并且许多成分稳定性差，半衰期也不尽相同〔7〕。因此，在实验中几乎无法模拟香烟烟雾的所有成分，但是可以模拟气道吸入的可溶的并能通过亲水性黏液层的香烟烟雾成分。这些可溶性成分穿过黏液层后作用于上皮细胞等气道组织。制备CSE通常是将香烟点燃后，使用抽气泵将香烟烟雾泵入培养基中，烟雾中的可溶成分溶于培养基中，从而形成实验用CSE，浓度定位100%。

3 CSE对肺部原代细胞的作用

CSE为研究香烟刺激对肺的损伤提供了一个有效的模拟方式，为从细胞分子学层面探索COPD患者气道气流阻塞的机制提供了一种有效的刺激方式。近年来，研究人员对CSE刺激各种肺部原代细胞的作用效应进行了广泛研究，获得了大量的实验结果。表1列举了文献报道中有关CSE对不同肺部原代细胞的作用效应。

表1 CSE对肺部原代细胞的作用

4 CSE对COPD气道重构的影响

持续性气流阻塞是COPD的典型特征。呼吸道内壁的反复受损和修复称为气道重构，而气道重构是影响气流阻塞的主要原因。气道重构主要是组织、细胞、分子等组成成分发生变化，而COPD气道重构的主要特征是小气道重构和肺实质重构，主要表现为对气道上皮、气道平滑肌、肺实质血管及ECM的影响。目前普遍认为引发气道重构的主要机制有持续性炎症反应、氧化与抗氧化失衡和蛋白酶与抗蛋白酶失衡，并且发病机制之间可相互影响，共同作用。使用肺部原代细胞体外培养模型可检验COPD或非COPD肺部细胞受香烟刺激之后的直接反映，为总结和分析香烟对COPD气道重构的影响提供了一种有利的方式。

4.1 CSE对小气道重构的影响 COPD患者小气道重构主要是指气道≤2 mm细支气管和终末细支气管的重构，主要表现为气道上皮细胞增生、鳞状细胞和杯状细胞变异、基底膜增厚、气道壁动脉外膜胶原沉积增高、小气道纤维化、血管增生〔1〕，重症COPD患者气道内还表现有气道平滑肌细胞增多。

COPD患者体内氧化压力增高，香烟等有害刺激可通过增高COPD患者机体内氧化压力的方式直接损伤肺部细胞，诱导细胞凋亡或死亡。研究发现，CSE破坏气道上皮细胞DNA结构，诱导细胞死亡〔15〕。 CSE增强成纤维细胞内氧化还原作用，促进细胞凋亡〔24〕。长期吸烟可诱发COPD，即使在患者戒烟之后其机体内氧化压力仍持续存在，并促使病情继续恶化。氧化压力也可增强肺部的炎症反应，激发嗜中性粒细胞和巨噬细胞的活性，研究〔31〕发现，COPD患者的肺泡巨噬细胞和外周血液中的活性嗜中性粒细胞释放的超氧自由基和过氧化氢增多。豚鼠动物模型研究显示，香烟刺激产生的氧化压力直接影响骨骼肌的功能，而并没有引起明显的炎症反应。使用人气道上皮细胞系BEAS-2b和Ⅱ型肺泡细胞系A549的研究表明，香烟中的亲脂成分干扰细胞线粒体的功能，从而增高胞内活性氧成分〔32〕。

香烟等有害刺激损伤气道壁，由于气道壁反复受损与修复导致纤毛细胞脱落，促进黏液细胞增生和黏液分泌增多，而受损的气道内清除异物和黏液的能力降低。研究表明，CSE降低纤毛的摆动频率〔16〕，香烟微粒的刺激可促进气道上皮内杯状细胞的分化。香烟诱导的氧化压力也与许多由趋化因子和炎症因子所介导的细胞内信号通路相关。气道上皮细胞和肺泡巨噬细胞受刺激之后释放促炎症因子和趋化因子，这些细胞因子聚集并激活更多的炎症细胞如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞以及淋巴细胞。这些炎症细胞响应炎症因子的作用而产生活性氧成分，并且进一步释放更多的细胞因子。因此这些炎症因子和趋化因子在持续性气道炎症和气道重构的过程中起着重要的作用。研究显示，CSE可直接调控树状细胞〔8〕和气道上皮细胞〔17〕内趋化因子和炎症因子的产生与释放，也可促进鼻病毒诱导的白细胞介素(IL)-8的释放〔20〕。肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-4等细胞因子可诱导杯状细胞分泌黏蛋白。此外，CSE诱导还氧化酶(COX)-2，通过激活芳烃受体，增高成纤维细胞中前列腺素(PG)E2)的表达〔24〕，嗜中性粒细胞受CSE刺激之后也可增高其PGE2的释放〔10〕，从而参与调节体内的炎症反应。

免疫细胞清除凋亡细胞的能力对消除炎症反应至关重要，COPD患者体内免疫细胞的吞噬能力受损，无法有效清除凋亡细胞，累积的凋亡细胞又引发了COPD患者体内组织坏死和持续性炎症。动物模型研究显示，氧化压力激活RhoA，破坏肺泡巨噬细胞细胞骨架的装配能力，从而影响巨噬细胞的吞噬能力〔33〕。原代细胞模型研究显示，CSE通过改变嗜中性粒细胞的细胞骨架结构而影响细胞的迁移能力，从而影响嗜中性粒细胞在肺部的扩散与存储〔34〕。CSE诱导的ECM环境的变化可增强巨噬细胞的黏附能力，从而影响巨噬细胞吞噬凋亡嗜中性粒细胞的能力。此外，CSE可降低肺泡巨噬细胞吞噬病原体的能力〔11〕，由于COPD患者的免疫细胞清除病原体的能力降低，导致COPD患者更容易受感染，进而加重气道炎症。

小气道变窄并逐渐消失是发生于肺泡结构破坏之前的气道重构，是COPD患者气道阻力增高的主要原因〔1〕，主要表现为气道壁增厚、气道平滑肌增生、ECM蛋白沉积增多，又被称为小气道纤维化。研究报道，COPD患者肺部ECM如弹性纤维、纤连蛋白等基质成分明显改变，这些基质成分改变可影响气道通气〔35〕。CSE增高COPD患者成纤维细胞中纤连蛋白和基底膜聚糖的表达以及ECM纤连蛋白的沉积〔25〕。CSE通过影响不同细胞因子的表达与分泌而调节细胞外基质的分泌与沉积。研究发现，CSE香烟烟雾中的脂多糖成分可诱导气道上皮细胞结缔组织生长因子的基因表达〔18〕，CSE通过下调细胞内Smad6信号蛋白的作用从而促进气道上皮细胞对转化生长因子(TGF)-β1的响应，并且CSE通过Smad3蛋白信号通路调节成纤维细胞血管内皮因子(VEGF)的表达。这些生长因子可促进胶原蛋白、纤连蛋白等细胞外基质结构蛋白的沉积以及肺部血管增生。并且，短时间低浓度的CSE刺激可升高气道平滑肌细胞中脑源性神经营养因子(BDNF)的释放从而促发气道高敏性〔29〕。此外，CSE可抑制气道上皮细胞〔19〕和成纤维细胞〔27〕中的基质金属蛋白酶(MMP)的释放与激活。MMP是降解ECM蛋白的主要蛋白水解酶，CSE一方面抑制MMP的活性另一方面增高ECM的表达，从而引起气道ECM过度沉积，气道壁增厚等气道纤维化现象。

4.2 CSE对肺实质重构的影响 重症COPD(肺气肿)患者肺实质重构主要表现为肺泡薄壁组织破坏、肺泡支撑结构消失、弹性回缩力降低。肺泡组织结构的破坏也是导致气流受限的主要原因。肺泡结构破坏，肺泡腔扩大，一方面是由于肺泡表面细胞凋亡或坏死，另一方面是由于支撑肺泡结构的ECM降解。

早在1964年，有研究报道α1-抗胰蛋白酶缺乏症与肺气肿密切相关〔36〕，α1-抗胰蛋白酶是主要的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制因子，患有先天性α1-抗胰蛋白酶缺乏症的吸烟者更容易患肺气肿〔37〕。进一步研究表明，敲除小鼠的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶基因可有效预防香烟诱导的肺气肿〔38〕。而CSE则可能通过若干已知的途径影响肺实质重构，包括：诱导肺泡细胞和内皮细胞凋亡〔9〕，参与凋亡信号通路的分子蛋白在肺气肿患者体内表达增高〔39〕，抑制气道上皮细胞释放TGF-β1和分泌纤连蛋白从而影响其修复能力〔21〕，抑制成纤维细胞的增殖能力，并通过影响成纤维细胞浓度调节成纤维细胞分泌纤连蛋白与TGF-β1的能力以及细胞本身的收缩性。

此外，有研究显示吸烟患者肺部嗜中性粒细胞和巨噬细胞数量增多，暗示嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和巨噬细胞蛋白酶在肺部的增多与肺部结构破坏密切相关〔40〕，肺气肿患者体内多种MMP表达量增高〔41〕，COPD患者的肺泡巨噬细胞内MMP表达量增高〔42〕。而CSE刺激体外培养的肺泡巨噬细胞可增高活性MMP-9的表达与释放〔12〕，以及肿瘤坏死因子-α 和MMP12的释放〔13〕。CSE也可直接作用于ECM蛋白，如阻断弹性蛋白之间的交联作用〔43〕。CSE也可通过上调肺泡细胞内的MMP表达量直接作用于肺泡细胞或降解ECM支架结构，从而起到破坏肺泡组织结构完整性的作用。

5 总 结

香烟烟雾是一种综合复杂的刺激原，通过多种分子信号通路途径影响综合性呼吸道疾病COPD〔44〕。虽然体外培养模型简易直观，有利于在分子和细胞水平下直接展示COPD的病理发展特征，但也存在不能完全模拟细胞在体内与不同细胞因子和不同形态细胞之间相互作用的缺陷。而且由于CSE的制作与使用的不一致，也发现在现有文献报道中存在一些不相一致的研究结果。因此，在研究与探索香烟对气道重构的影响时，仍然需要动物模型实验和临床实验以验证在体外细胞培养模型中所获得的观察结果。

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〔2013-12-18修回〕

(编辑 袁左鸣)

国家自然科学基金资助项目(No.11172340)；重庆市科委百名杰出科技领军人才培养计划；高等学校博士学科点专项科研基金(新教师类，No.20120191120032)；重庆市自然科学基金计划一般项目(No.cstc2012jjA0588)；中央高校基本科研业务费(No.CQDXWL-2012-123;CQDXWL-2013-028)

邓林红(1960-)，男，博士，教授，主要从事细胞生物力学吸哮喘研究。

陈 玲(1985-)，女，博士，主要从事细胞分子生物学，气道重物，慢性阻塞性肺疾病、细胞力学研究。

R3

A

1005-9202(2015)12-3466-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.135

1 常州大学生物医学工程与健康科学研究院