hTERT 永生化细胞的研究进展及应用前景

张敏，陈小云，王磊，王栋，蒋桃珍，王静文

（中国兽医药品监察所，北京100081）

hTERT 永生化细胞的研究进展及应用前景

张敏，陈小云，王磊，王栋，蒋桃珍，王静文

（中国兽医药品监察所，北京100081）

人端粒酶逆转录酶基因（hTERT）诱导的永生化细胞兼具原代细胞的生物学特性和传代细胞系连续传代的能力，是一种理想的细胞来源，在基础研究、临床应用和生物工程领域具有无可比拟的优势。本文主要就hTERT永生化细胞的研究进展及应用前景作一综述。

永生化；端粒；端粒酶；人端粒酶逆转录酶基因（hTERT）

正常细胞因其有限的增殖能力使其在基础研究、临床应用和生物工程领域的作用受到局限。在许多实际应用中，理想的是获得具有持续增殖能力的细胞。一直以来，人们都在试图解决这一问题，目前用的较多的方法是将SV40病毒、人乳头瘤病毒、EB病毒等转染入细胞中，建立永生化细胞系；另外，还可以将原癌基因导入细胞或利用放射性因素、化学药物的刺激建立永生化细胞，但这些方法建立的永生化细胞均存在使细胞恶性转化的危险。因此，急切需要发展一种新方法既能让正常细胞跨越老化这一障碍，又能不丢失其正常特性。近年来报道较多是将人端粒酶逆转录酶（hTERT）转入细胞内使其永生化，并且已经证实这些永生化的细胞跟原代细胞的特性相似，没有发生核型的改变，也无致瘤性。本文对hTERT介导的永生化细胞研究进展及应用前景做一论述。

1 细胞永生化的概念

细胞永生化（cell immortalization）是目前细胞生物学研究的热点和难点之一，是指细胞获得持续生长增殖能力的特性。正常组织来源的细胞，经过有限次的细胞传代后，会停止增殖，发生衰老和死亡。一般认为永生化是体外培养细胞经过自发的或外界因素的影响从增殖危机中逃逸，从而具有无限增殖能力的过程。细胞自发性永生化的几率非常小，啮齿类动物细胞为10－5～10－6，而人类细胞则更罕见，小于10－12。因此，学者们通过基因转染等技术将外源性永生化基因转入目的细胞内，以增加永生化的发生几率，进而建立永生化细胞系［1－2］。

2 细胞永生化的机制

端粒是位于真核细胞线性染色体末端的特殊结构，由一简单重复的富含碱基G的DNA序列及其相关蛋白组成，国内外研究表明端粒的长度与细胞有丝分裂次数相关，体外培养的细胞每分裂一次，端粒进行性缩短，当缩短到一定程度而不能维护染色体的稳定时，细胞失去分裂增殖的能力，发生衰老。越来越多的例子表明端粒长度控制着衰老的进程，端粒的缩短是触发衰老的分子钟。从不同年龄或原代细胞、传代细胞测定的端粒长度结果都显示端粒随年龄或分裂次数增加而缩短，表现为年龄或分裂次数的函数。

端粒酶是一种能延长端粒末端的核糖核蛋白酶，是一种专一的逆转录酶，能以自身的RNA为模板，从端粒DNA 3’－OH末端延伸端粒或合成新的端粒DNA，以补偿细胞分裂时染色体末端的缩短，从而维持端粒的长度，使细胞不会因端粒耗尽而出现凋亡。因此，端粒酶在保持端粒稳定、基因组完整、细胞长期的活性和潜在的继续增殖能力等方面有重要作用［3－5］。但是，在正常人体细胞中，端粒酶的活性受到相当严密的调控，并不能检测到端粒酶的活性，只有在造血细胞、干细胞和生殖细胞，这些必须不断分裂克隆的细胞之中，才可以检测到具有活性的端粒酶［6－8］。

目前，已经得到实验研究证实的永生化机制是“端粒假说”理论：正常人或动物原代细胞在体外经过多次分裂后，细胞进入衰老期（senescence，M1期），此时细胞对生长因子等失去反应，产生DNA合成蛋白抑制因子，细胞周期检查点发送细胞周期停止信号，DNA合成停止，细胞停止分裂开始衰老，但不一定死亡。而病毒、原癌基因和抑癌基因突变体等则可以抑制M1期机制，细胞绕过M1期继续生长。细胞经过20～30群体倍增次数（population doublings，PDs）后，进入危机期（crisis，M2期），细胞出现退化，如双着丝粒形成、染色体变短而失稳，分裂细胞逐渐减少，绝大多数细胞发生凋亡，只有罕见的细胞在一些因素影响下，端粒酶被激活，以它自身RNA为模板不断合成端粒DNA来补充和延长端粒有限长度，以维持端粒长度，恢复染色体的稳定性使细胞得以逾越M2期，细胞就获得了无限分裂和增殖的能力而成为永生化细胞［2］。

端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）作为端粒酶的催化亚单位和限速酶，在端粒酶活性维持中起关键作用，这就为细胞永生化提供了新的思路。在原代培养的细胞中转入端粒酶逆转录酶（TERT），并稳定表达，能维持端粒的长度，使细胞易于永生化。TERT在进化上相对保守，几乎所有物种均含有六个逆转录酶元件和一个端粒酶特异性元件。目前，研究最多的就是在原代细胞中转入人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT），使细胞永生化［9－10］。

3 hTERT永生化细胞的国内外研究现状

3.1 hTERT永生化细胞的优越性 相对于传统的永生化基因，即病毒、原癌基因等，hTERT具有许多优越性。首先，hTERT介导的永生化细胞是正常细胞而非转化细胞。研究表明它们具正常生长率、核型、呈现接触抑制和锚着依赖性，不具有致癌性和软琼脂克隆形成能力等，同时其DNA被紫外线或电离辐射损伤后，P53和P21的反应性诱导与正常细胞相同。当它们处于增殖期时pRb发生过磷酸化，汇合时则发生低磷酸化并下调，而P16INK4a水平则保持稳定，符合正常细胞特征［11］。

3.2 hTERT永生化细胞的研究方法 学者们通常采用基因转染技术将外源性永生化基因导入目的细胞内，包括电穿孔法、磷酸钙沉淀法、脂质体转染法以及逆转录病毒和腺病毒介导转染法。由于表达载体的不同，hTERT导入目的细胞的具体方法不尽相同。有学者构建了两个真核表达载体pGRN145和pZeoSV－hTERT，采用电穿孔法有效地导入了人视网膜色素上皮细胞和包皮成纤维细胞；若hTERT插入逆转录病毒载体如pBabe puro和pBabe hygro，则需要将质粒导入包装细胞系后产生的病毒上清感染目的细胞；由于电穿孔法需要大量的目的细胞，而逆转录病毒介导转染法虽然效率高但操作较为复杂，近年兴起的脂质体介导转染法因为效率高、操作方便等优点而被广泛应用，相应的真核表达载体pCI－neo－hTERT也有效应用于脂质体转染法［12］。

经hTERT永生化的细胞能无限增殖生长，可长期传代，但并不改变细胞本身的特性，目前主要用以下几种方法对其进行鉴定：Southern－blot检测外源基因的整合情况；Western－blot检测外源基因的表达情况；端粒酶重复扩增PCR方法检测端粒酶活性；免疫细胞化学技术检测细胞的特异性抗原；体外及体内法对细胞的致瘤性进行检测［1］。随着永生化细胞研究的不断深入，将有越来越多、更灵敏方便的方法对其进行鉴定。

3.3 hTERT永生化人源细胞的国内外研究进展在人原代细胞的研究上，永生化细胞的研究在国内外都备受亲睐。1998年，Bodnar等［13］首先利用外源的hTERT转染人视网膜色素上皮细胞和包皮成纤维细胞，结果细胞分裂旺盛，细胞寿命延长了至少20PDs。后续研究发现，此类细胞可持续增殖，至少达未转染细胞PDs的2－3倍。美国Clontech公司与Geron公司转染hTERT至人视网膜色素上皮细胞，合作推出第一种商品化的永生化正常细胞系hTERT－RPE1，其较正常细胞增殖快，平均每周达5－6PDs，有3个克隆传代多于300代［14］。Wang J等［15］用正常的人乳腺上皮细胞转染hTERT后，细胞寿命超过了未转染对照组细胞寿命的40PDs。Wieser等［16］的研究结果表明，外源表达hTERT足以使肾近端小管上皮细胞永生化，永生化细胞的各项表型与原代细胞一致，经过连续90次群体倍增后，转化细胞依然保持良好的遗传稳定性。全球最大的生物材料资源中心美国典型培养物保藏中心（ATCC）也致力于人类细胞的hTERT永生化细胞系的构建，目前已构建了10余种hTERT永生化细胞系，并实现了商品化，一些永生化的细胞在临床上已经得到了应用，如细胞治疗和构建工程化组织等［17－19］。国内刘官智等［20］采用脂质体转染法，将hTERT基因导入人毛乳头细胞中，已连续传至65代，且具有正常细胞的生物学特征；高雯等［21］通过端粒酶导入技术成功构建永生化人输卵管上皮细胞；陈之峰等［22］利用反转录病毒载体将hTERT基因转入口腔黏膜上皮细胞，进行一系列检测后显示，转染细胞增殖活跃，群体倍增数超过80，hTERT基因在转染细胞中稳定表达，而在未转染细胞中不表达。永生化获得成功的报道还有人肺成纤维细胞、皮肤成纤维细胞、人脐静脉血管内皮细胞等等。

3.4 hTERT永生化动物源细胞国内外研究进展近年来，动物源细胞永生化的研究也取得了很大的进展。Sabine等［23］采用hTERT基因转染技术，获得了永生化的猪输卵管上皮细胞系，该细胞具有端粒酶活性，并与上皮细胞标志物角蛋白具有免疫反应；Sungwook［24］用转染端粒酶hTERT和猿猴病毒SV40LT两种方法，成功建立了猪肾永生化细胞系，并传至30代，发现两种方法获得的细胞在软琼脂上均不生长，在10%FBS－DMEM培养基中增殖能力明显快于原代细胞，为病毒研究提供了很好的细胞来源；Sagong等［25］采用反转录病毒介导的基因转染系统，将hTERT cDNA转染猪肺泡巨噬细胞，稳定转染细胞能表达hTERT基因，使细胞永生化，该永生化细胞未影响细胞表面CD163受体的表达水平，对美洲型和欧洲型PRRSV毒株均高度易感。国内研究者在动物细胞永生化方面也做了一些研究，方泽强［26］等2003年采用新西兰大白兔的颞颔关节表面软骨组织进行的hTERT转染实验结果证实：转染hTERT的软骨细胞内可检测到明显的端粒酶活性，且具有较为旺盛的分裂能力，传至100代后细胞仍可以增殖，除细胞体积有缩小外，其他生物学特性基本正常，未经转染hTERT的对照组软骨细胞未检测到端粒酶活性，传至第8代已经停止分裂；洪海霞等［37］将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pCI－neo－hTERT导入原代培养的猪脐静脉血管内皮细胞，激活了其端粒酶活性，延长了细胞在体外培养的寿命，获得了永生化猪脐静脉血管内皮细胞并传至56代，且该细胞仍保持其正常的生物学特性和分泌功能，随后，该研究小组将CSFV E2基因导入猪脐静脉血管内皮细胞获得表达，而且成功诱导小鼠产生抗E2蛋白的抗体［28］；李吉霞等［29］转染hTERT基因成功建立永生化牛乳腺上皮细胞，转染后的细胞形态正常、生长活力旺盛、核型正常、无致瘤性，且有端粒酶活性，已成功传至68代，随之将该细胞作为供核细胞，初步运用于核移植的研究；曹晖等［30］从2.5～3月龄胎猪胰腺组织中分离出间充质干细胞，转染hTERTJ基因永生化胎猪胰腺源间充质干细胞，具有很强的体外增殖能力，体外能够分化为其他类型细胞，可为组织工程和再生医学的研究提供足够的细胞资源。

4 hTERT永生化细胞的应用前景

针对疫病的防控，我国主要采取以疫苗免疫接种为主的综合性防治措施，疫苗发展主要经历了组织苗、原代细胞苗和传代细胞苗的过程。组织苗使用活体动物生产，生产量有限且成本高；原代细胞苗在制备工艺上虽然优于组织苗，但却存在原代细胞传代次数有限、不同批次细胞质量和敏感性有差异、易造成外源病毒污染等问题，阻碍了其在疫苗上的进一步发展。为了克服组织苗和原代细胞苗的缺陷，研究者们用传代细胞适应病毒增殖并获得成功，从而使疫苗的生产更简单、快速，同时也使疫苗的生产更标准化、低成本和规模化，使疫苗生产在生物反应器上批量工厂化生产变为现实，从而大大优化了疫苗生产工艺、提高了病毒滴度。可以说，传代细胞系的使用给疫苗的生产带来了突破性的进展。但传代细胞系的使用也有其局限性，特别是其运用于活疫苗生产时，其株系特性，特别是有无致瘤性，不仅直接影响到疫苗的质量而且关系到人畜的健康与安全。致癌基因模型的风险性评估显示，体内基因组中含有某一具有活性的致癌基因100拷贝即可引起1／109个受体发生转化。因此，研究认为，当细胞残留DNA高于100pg／剂量时，细胞DNA潜在的风险将不容忽视［31］。若用致瘤性细胞系生产疫苗，疫苗癌基因会随活苗接种而整合入体内，人类若接种有癌基因的疫苗或长期食用整合有癌基因的肉类，有可能出现新一代癌症，酿成新的公共卫生问题。国外及中国药典对传代细胞系用于疫苗生产的传代代次、DNA残留量都有严格的控制［32－33］。而永生化的细胞克服了原代细胞和传代细胞系的缺陷，具有原代细胞生物学特性，又兼具传代细胞系均一、稳定、操作简单且能长期传代培养的特性，在疫苗的生产上将是较好的候选细胞。

来源于靶宿主组织的细胞，是病毒增殖的理想工具。目前，应用于病毒性疾病研究的细胞较少，特别是在动物医学研究上，而且每种病毒能增殖的细胞有限，细胞系的相对缺乏影响了病毒学研究的发展。永生化细胞，具有原代细胞的生物学特性，这就为病毒性疾病的研究提供了很好的感染模型，为研究病毒生长、增殖、代谢规律及与细胞的相互作用提供了优良的细胞基质。

在体外延长细胞寿命在研究生长和分化的生理生化特征方面，克隆的永生化细胞比已经建立的肿瘤细胞系具有更大的优势，因为它更能代表机体内的正常生理状态，有助于研究器官衰老现象发生的机制，为我们攻克肿瘤，研究干细胞的特性，控制细胞的增殖分化等许多方面的研究奠定坚实的基础。同时永生化在体外可多次传代，具有相对稳定的增殖特性和功能状态，将其作为细胞工程和组织工程等研究领域的标准细胞，有助于体外实验的标准化。永生化细胞也可作为体内治疗的载体，长期而稳定地发挥我们所要求的疗效，而不会引起不良反应，现已有人将永生化细胞应用于临床研究。

5 展望

从上个世纪末至今，hTERT永生化细胞的研究不过短短二十几年的时间，就已经取得了令人瞩目的成就，利用hTERT构建的永生化细胞系也已经在基础研究及医学领域中发挥了初步作用，并显现出很好的应用前景。但同时这个新兴的领域还有很多未知的东西需要我们和后来的人们去逐一破解，比如hTERT的分子调控机制、永生化和肿瘤细胞的关系、永生化细胞的局限性、对不同细胞采用何种永生化方法等。总之，永生化细胞的研究是困难与机遇并存、问题与结果碰撞的起步阶段，随着技术的完善和研究的深入，相信永生化细胞将在细胞学及医学领域发挥重要作用。

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（编辑：陈希）

The Research Progress and Application Prospect of Immortalized Cell by hTERT

ZHANG Min，CHEN Xiao－yun，WANG Lei，WANG Dong，JIANG Tao－zhen，WANG Jing－wen
（Chine Institute of Veterinery Drug Control，Beijing 100081，China）

Immortalized cells induced by human telomerase reverse transcriptase（hTERT）are ideal cell source for their biological specificity of primary cell line and infinite proliferative capacity of passage cell line.They have shown superior advantage in fundamental research，clinical application and bioengineering.In this review，we introduced research progress and application prospect of immortalized cells induced by hTERT.

immortalization；telomere；telomerase；human telomerase reverse transcriptase（hTERT）

2015－01－06

A

1002－1280（2015）02－0058－05

Q28

张敏，硕士，从事动物细胞与病毒学方面研究。E－mail：zmbooksea＠163.com