寄生虫半胱氨酸蛋白酶核酸疫苗的研究进展与应用前景

王 钊，王 好，钱爱东，刘艳辉，祖岫杰，周井祥∗

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，长春130118；2.吉林省水产科学研究院，长春130033）

寄生虫半胱氨酸蛋白酶核酸疫苗的研究进展与应用前景

王 钊1，王 好1，钱爱东1，刘艳辉2，祖岫杰2，周井祥1∗

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，长春130118；2.吉林省水产科学研究院，长春130033）

就寄生虫半胱氨酸蛋白酶的一些生理生化与免疫学性质进行了概括，阐述了该酶与宿主免疫应答之间的作用关系，证明了该酶具有作为研制高效核酸疫苗的条件，同时综述了寄生虫半胱氨酸蛋白酶核酸疫苗的发展以及应用前景。

寄生虫；半胱氨酸蛋白酶；核酸疫苗

寄生虫引起的疾病直接或间接影响着人类的健康与经济发展，人们迫切需要新颖高效的方法来防治寄生虫，但是寄生虫无论是从大小上，还是从生化成分或入侵模式上来讲都与细菌或病毒存在着很大区别。寄生虫的生活史复杂、表面抗原多样且易变、多数拥有背膜与壳片等诸多性质往往诱发宿主复杂的免疫反应，而且大多数寄生虫的靶寄生位点是宿主的免疫豁免区［1］，因此普通药物和疫苗很难杀灭虫体，这导致目前对寄生虫的防治捉襟见肘。由于核酸疫苗可避免常规药物与传统疫苗的治疗缺陷，一方面具有高效、高特异性、通用性强、绿色环保、成本低等优点，另一方面在寄生虫治疗领域罕有应用，因此成为了抗寄生虫治疗的研究热点［2］。寄生虫抗原按生化成分通常分为蛋白质、糖蛋白、多糖、核酸和类脂等，目前传统疫苗与核酸疫苗多应用结构蛋白作为基础，但对于寄生虫来说结构蛋白的抗原性具有种、属、株的特异性，即便是同一株也具有期的特异性［3］，免疫学性质不稳定，因此并不具备研制高效通用疫苗的条件。最近的研究发现一些膜内分泌蛋白，尤其是酶类，不仅具有很强的抗原性，而且在同一虫体的不同发育时期均有分泌，参与虫体的入侵、吸附、繁殖、免疫逃避等过程，并在寄生虫与宿主之间的相互作用中扮演重要角色［4］。半胱氨酸蛋白酶是一种广泛存在于寄生虫的分泌蛋白，在寄主体内寄生虫产生的半胱氨酸蛋白酶参与虫体整个生活史，影响宿主Th细胞的分化，调节Th1与Th2应答，干预寄主Th1／Th2应答平衡来达到寄生目的［5］。 早在 1995年，Jankovic等［6］就发现曼氏血吸虫分泌的一种钙依赖性半胱氨酸蛋白酶的一个亚基sm－p80可诱导Th1型免疫应答因其具有免疫原性，并已经作为研制疫苗的候选抗原。Schnapp等［7］在2002年发现克氏锥虫的一种叫Cruzipain的L样半胱氨酸蛋白酶可以诱导鼠脾脏细胞Th2细胞因子的产生，主张将这种酶作为预防克氏锥虫感染的候选疫苗保护性抗原。2003年Pollock等［8］发现墨西哥利士曼原虫的半胱氨酸蛋白酶CPB基因是致病力的关键基因。Cameron等［9］在2004年发现由墨西哥利士曼原虫产生的半胱氨酸蛋白酶可作为一种调节因子对小鼠骨髓巨噬细胞信号通路NF－κB进行调控使其失活从而降低IL－12细胞因子的释放。Swenerton等［10］在2010年发现利士曼原虫的半胱氨酸蛋白酶寡肽B是参与虫体免疫逃避的重要因素。这些学者的研究成果丰富了寄生虫半胱氨酸蛋白酶与宿主免疫应答的作用关系，在一定程度上证明了寄生虫半胱氨酸蛋白酶具有作为抗原来研制疫苗的潜力。虽然国内外有一些寄生虫半胱氨酸蛋白酶核酸疫苗的相关研究，但半胱氨酸蛋白酶作为一种新的抗原用于研制核酸疫苗仍具有很多技术空白，因此抗寄生虫半胱氨酸蛋白酶核酸疫苗将具有很大的研究余地与良好的应用前景。

1 半胱氨酸蛋白酶

1.1 蛋白酶 蛋白酶是具有生物活性的大分子物质，是各种寄生虫的重要组成成分。蛋白酶可以大致分为外肽酶和内肽酶两组。前者具有选择性裂解羧基末端和氨基末端的能力，后者则专门裂解多肽的内链。蛋白酶还可以根据其催化活性位点的化学组成成分进一步细分为五种类型：半胱氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、苏氨酸和金属蛋白酶。这些不同的催化活性位点在蛋白质裂解的过程中起到重要作用。

1.2 寄生虫半胱氨酸蛋白酶 寄生虫半胱氨酸蛋白酶分为CA、CD两大主族，这两大族仍可细分为不同的家族，很多重要的寄生虫蛋白酶属于CA主族下的C1、C2家族，且全都为分泌型或胞内作用型。属于C1家族的酶可以细分为三个亚族：博来霉素水解酶、L样组织蛋白酶、B样组织蛋白酶。拥有钙结合域的钙蛋白酶则属于C2家族。存在于溶酶体状隔间中的豆荚样蛋白酶属于CD主族［11］。

编码寄生虫半胱氨酸蛋白酶的基因广泛存在于各种寄生虫中，在寄生虫的生活史中是极为重要的物质［12］。比如虫体对营养的摄取，在宿主体内的移行，生殖发育，参与逃避宿主的免疫监视，对细胞的浸润与毒力，脱包囊，虫卵的孵化与蜕皮等过程均与该酶有重要关系［13］。其中最主要的功能之一是通过影响Th1或Th2型应答来调节宿主的免疫应答从而使宿主无法有效驱逐入侵机体的寄生虫，从而达到免疫逃避的目的。因此该酶将决定寄生虫能否长期寄生于宿主体内。

1.3 寄生虫半胱氨酸蛋白酶的免疫原性与免疫逃避机制 寄生虫分泌的半胱氨酸蛋白酶对于宿主来说是一种具有很强免疫原性的异己物质。成熟的肝片吸虫拥有两种半胱氨酸蛋白酶 Fas1、Fas2，通过免疫分析发现这两种酶是免疫优势抗原具有较高的敏感性与特异性。大片吸虫分泌的半胱氨酸蛋白酶具有很强的免疫原性，是抗寄生虫感染的潜在保护性抗原［14］。曼氏迭宫绦虫裂头蚴的半胱氨酸蛋白酶能够引起宿主特异性IgE抗体反应。屋尘螨排泄物中的Der p1（半胱氨酸蛋白酶家族）是一种常见的过敏原。有报道称在感染了血吸虫的成年人肠道中得到的两种半胱氨酸蛋白酶与其他哺乳动物宿主血清发生了特异性抗体反应。以上实例说明了半胱氨酸蛋白酶具有一定的免疫原性，可用于疫苗的构建与诊断。

肝片吸虫分泌的一种被命名为FgCatL1H的L样组织蛋白酶（半胱氨酸蛋白酶家族）能有效作用于宿主的I型胶原蛋白、层粘连蛋白、以及免疫球蛋白IgG等底物，该酶可水解粘连蛋白，并将宿主的免疫球蛋白裂解为Fab与Fc片段，因此降低了宿主嗜酸性粒细胞的粘附能力与巨噬细胞对寄生虫的免疫作用［15］。另外该虫利用诱导后的半胱氨酸蛋白酶对细胞表面CD4进行切割，使得肝片吸虫用抑制了淋巴细胞的增殖，抑制了宿主的Th1型反应，实现免疫逃避。溶组织阿米巴分泌的半胱氨酸蛋白酶的高效底物是IgA与IgG抗体［16］，是该虫免疫逃避机制中最重要的因素。同样，肥头绦虫分泌的半胱氨酸蛋白酶也可以降解宿主的IgG抗体。一些寄生虫分泌的半胱氨酸蛋白酶也可以诱导白介素4参与抑制宿主的Th1型免疫应答，降低了宿主对寄生虫的免疫能力。以上表明寄生虫蛋白酶具有降解抗体和调节细胞免疫应答的功能，进而通过这种机制阻止宿主对寄生虫的免疫反应。有报道称半胱氨酸蛋白酶还可协助虫体进行新陈代谢、生长发育、组织皮层的更新等，以此确保抗原的不断变化帮助虫体逃避宿主的免疫监视［17］。由于半胱氨酸蛋白酶拥有以上性质，因此使寄生虫获得免疫逃避能力。由于重组半胱氨酸蛋白酶核酸疫苗不仅可诱导机体产生Th1型细胞免疫应答，还可以刺激机体的体液免疫应答，持续产生特异性抗体，与半胱氨酸蛋白酶形成紧密复合物，封闭了酶的活性中心而影响其本身的催化活性来抑制该酶的作用。基于核酸疫苗的这种特性，人们便可实现对寄生虫感染的有效防护。

2 一些寄生虫半胱氨酸蛋白酶核酸疫苗研究进展

对寄生虫半胱氨酸蛋白酶研究的深入揭示出该酶对于免疫防治具有重要价值。无论是从生物学特性还是从化学性质上来看，半胱氨酸蛋白酶都具备作为化学治疗靶物质的特点，通过抑制该酶的活性便可以达到阻断寄生虫入侵、繁殖、营养等诸多重要生理环节。采用核酸疫苗使宿主能够产生针对该酶的特异性抗体进而实现对寄生虫的防治是一种新颖而巧妙的方法，目前已经有相关基因与蛋白酶的研究，但多数停留在试验阶段，有待于进一步发展。

2.1 变形虫 变形虫可引起人类肠炎与腹泻，使易感性小鼠与抗性小鼠分别产生Th2与Th1型免疫反应。何光志等人使用半胱氨酸蛋白酶基因（EhCP112）制成抗溶组织阿米巴重组疫苗接种仔猪后，发现对宿主产生了显著的保护性［18］。这种半胱氨酸蛋白酶是溶组织阿米巴感染细胞和造成组织损伤时的重要物质。虽然接种核酸疫苗后的宿主并没有产生显著的抗体反应，但却使宿主得到了很强的免疫保护，这表明在寄生虫感染时细胞免疫具有很重要的地位。因此针对细胞免疫设计特异性表达的核酸疫苗来治疗感染将会事半功倍。

2.2 鞭毛虫 半胱氨酸蛋白酶基因（CPA和CPB）制成的抗利士曼原虫重组蛋白与重组质粒在BALB／c小鼠体内进行了实验，结果发现可以给予宿主部分保护能力，并使 Th2型应答转变为 Th1型应答［19］。但是CPA和CPB基因单独接种并不能产生保护力，只有联合接种才能产生效果［20］。应用墨西哥利士曼原虫的CPB基因、金属蛋白酶基因（GP63）、同源蛋白激酶C受体基因（LACK）和亚马逊属膜糖蛋白基因（GP64）制成一种复合核酸疫苗，也获得与上述相似的结果［21］。鲑隐鞭虫金属蛋白酶与半胱氨酸蛋白酶重组核酸疫苗接种鲑鱼后，发现前者增强了鲑鱼的保护力，而后者则诱发宿主的易感性［22］。这说明半胱氨酸蛋白酶对于宿主的免疫影响具有多物质协同性，如果抑制其中任何相关元素都可能导致寄生虫毒力的减弱甚至消失。因此构建核酸疫苗的同时需要考虑相关协同物质的表达。

2.3 吸虫 小鼠接种了肝片吸虫L样半胱氨酸蛋白酶核酸疫苗后，体内虫卵的数量明显减少。斯普拉－道来氏大鼠接种了华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶（CsCp）核酸疫苗后呈现出显著的保护性［23］。小鼠感染曼氏血吸虫45 d后接种该虫天冬酰胺转肽酶（SM32）核酸疫苗，并没有明显降低宿主体内的虫体数量，但是却发现可以降低虫体的繁殖能力，其中钙蛋白酶大亚基sm－p80蛋白疫苗为小鼠提供了39%的保护力，配合佐剂使用后保护力提升到44%并使宿主体内虫卵含量降低了29%～39%。最近研究表明编码sm－p80基因的重组核酸疫苗能降低宿主体内59%的虫体含量和84%的虫卵含量［24］。这些结果揭示了不同类型的半胱氨酸蛋白酶核酸疫苗对宿主均能产生一定的保护性，然而高效的核酸疫苗仍然需要佐剂的配合，筛选更具有保护性的基因与佐剂将成为热点。

2.4 粘孢子虫 碘泡虫属的脑粘体虫分泌一种具有很强免疫原性的半胱氨酸蛋白酶，基因（MyxCP－1）诱导虫体表达一种Z样组织半胱氨酸蛋白酶，该酶可引起鱼类患婆娑病。通过实时荧光定量PCR检测发现在感染鱼的体内各种组织均有该酶的表达，并通过免疫学分析发现阻止该酶的表达可以缓解病程［25］，这为鱼类抗粘孢子虫核酸疫苗的研制提供实验基础。

综上所述，前人实验结果均充分表明了半胱氨酸蛋白酶是寄生虫寄生机制的重要组成成份，也是其毒力的主要影响因素。由于该酶对宿主的毒性常具有多物质协同性，通过人工方法干扰该酶的活性或抑制相关物质的分泌都可以影响寄生虫的生存，因此构建经过优化的核酸疫苗通过主动免疫宿主调节其Th免疫应答类型，使宿主获得较强的保护性，证明了半胱氨酸蛋白酶核酸疫苗应用的可行性。

3 展望

近来，对寄生虫半胱氨酸蛋白酶结构和功能的研究已基本清楚，作为抗寄生虫感染防治中的新物质具有很充分的科学依据和实验背景。进一步分析寄生虫半胱氨酸蛋白酶依赖性寄生机制与影响宿主Th1／Th2型免疫应答平衡的分子机制，可从根本上认识半胱氨酸蛋白酶核酸疫苗对宿主的保护原理，为早日实现高效重组半胱氨酸蛋白酶核酸疫苗的上市奠定理论与实验基础。目前通过实验已经证实了应用半胱氨酸蛋白酶核酸疫苗防治对哺乳动物危害性极强的吸虫、原虫等寄生虫的效果要优于普通药物与传统疫苗，使人们对寄生虫疾病防治的概念上升到一个新层次。半胱氨酸蛋白酶核酸疫苗在对经济动物寄生虫的防治中也将发挥其安全、环保、高效等优势，进而大幅降低因寄生虫病治疗困难而带来的经济损失。因此未来利用半胱氨酸蛋白酶作为核酸疫苗防治寄生虫感染将具有广阔的应用前景。

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（编辑：李文平）

Research Progress and Application Prospects of Parasite Cysteine Proteases DNA Vaccine

WANG Zhao1，WANG Hao1，QIAN Ai－dong1，LIU Yan－hui2，ZU Xiu－jie2，ZHOU Jing－xiang1∗
（1.College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun130118，China；2.Jilin Academy of Fishery Sciences，Changchun130033，China）

Some of the physiological，biochemical and immunological properties of the parasite cysteine proteases had been generalized.The role of the relationship between the enzyme and the host immune response had been described which proved the cysteine proteases could be potential antigens in DNA vaccine.Meanwhile the development and application prospects of parasite cysteine proteases DNA vaccine has been reviewed.

parasites；cysteine protease；DNA vaccine

2014－11－17

A

1002－1280（2015）01－0060－05

S852.7

吉林省自然科学基金（20140101035JC）

王 钊，研究生，从事粘孢子虫研究工作。

周井祥。E－mail：zhjxnd＠126.com