内质网应激与肿瘤细胞耐药的相关机制

颜媛媛，何 苗，魏敏杰

(中国医科大学药学院药理学教研室，辽宁 沈阳 110000)

内质网应激与肿瘤细胞耐药的相关机制

颜媛媛，何 苗，魏敏杰

(中国医科大学药学院药理学教研室，辽宁 沈阳 110000)

内质网是真核细胞内一种重要的细胞器，当细胞低氧、糖类供应不足或有化学药物处理时均可引发内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)。目前研究表明，内质网应激可激活多条通路，其中以未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)通路研究最为广泛。UPR通路激活后，可参与调控肿瘤细胞耐药。其中，参与的机制涉及DNA损伤修复、凋亡抑制、自噬等。

内质网应激; 肿瘤耐药; UPR; ERS; 凋亡抑制; 自噬

内质网是真核细胞内一种重要的细胞器，是蛋白质翻译后合成、修饰、折叠、分泌以维持细胞功能的重要场所。内质网除了参与蛋白质的合成和功能的维持与调节外，也参与调控脂质的合成与代谢、Ca2+的储存与释放、糖类代谢等。内质网对于细胞内外界环境的变化非常敏感，当细胞低氧、Ca2+流失或Ca2+超载、糖基化抑制、糖类供应不足，化学药品紫杉醇(paclitaxel)、衣霉素(tunicamycin) 、毒胡萝卜内酯(thapsigargin)和二硫苏糖醇(dithiothreitol)等引起的未折叠蛋白或错误折叠蛋白增多时，都可以造成内质网内稳态的失衡从而引发内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)[1]。

ERS一旦发生，将激活一系列的级联反应通路，主要有：未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)，内质网超负荷反应(endoplasmic reticulun overload reponse, EOR),固醇调节级联反应,错误折叠蛋白转运至内质网介导的蛋白质降解(ER-associated degradation，ERAD)或引发自噬。其中，UPR和EOR主要由蛋白质加工紊乱所致，而固醇级联反应由内质网表面合成的胆固醇损耗激发。目前，研究最为广泛和透彻的ERS级联反应通路为未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)[2]。

1 UPR

在哺乳动物细胞中，UPR主要通过三个内质网应激感受器通路减少总蛋白质合成，并通过增强ERAD降解错误折叠蛋白。这三条主要的感受器包括：双链RNA依赖的蛋白激酶样ER激酶(double-stranded RNA-activated protein linase-like, PERK)、活化转录因子6(activating transcription factor 6, ATF6)和肌醇需酶1(inositol-requiring enzyme 1, IRE1)；它们都属于内质网跨膜蛋白，负责将内质网腔内信号传导至细胞质和细胞核。在正常条件下，内质网腔内的葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein of 78 ku, GRP78)，也称分子伴侣免疫球蛋白重链结合蛋白(heavy chain-binding protein, BIP)，分别与三种感受器结合，形成稳定的复合物。当内质网内未折叠蛋白或错误折叠蛋白不断累积，未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网腔内与三个感受器竞争GRP78，并与之结合。三个感受器与GRP 78解离后，分别激活各自下游通路，从而引发相关信号转导而产生多种细胞调节[3]。

1.1 IRE1-XBP1IRE1是I型跨膜蛋白，其细胞质内区域具有丝氨酸/苏氨酸激酶位点和内核糖核酸酶活性(RNase)。XBP1是碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper, bZIP)结构蛋白，属于环腺苷酸应答元件连接蛋白/激活因子(cyclic AMP response element binding protein/activation factor, CREB/ATF)家族中的一种转录因子。当ERS发生时，IRE1与GRP78解离，形成二聚体或寡聚体，并自磷酸化，随后启动了激酶和RNase活性。IRE1活化后，剪切了XBP1的一个含有26个核苷酸的内含子，使之成为活化的XBP1s。XBP1s可以进入细胞核内与未折叠反应元件结合，从而激活大量的下游靶基因。其中包括：内质网降解类似蛋白(ER degradation enhancing alphamannosidase like protein, EDEM),内质网应激伴侣分子蛋白，炎性反应，蛋白质二硫化物异构酶(protein desulfide isomerase, PDI)[4]。

1.2 PERKPERK属I型跨膜蛋白，胞质中存在丝氨酸/苏氨酸激酶位点。尽管PERK和IRE1在序列上同源性不高，但是在内质网腔内PERK与IRE1结构上有相似性。在功能上，当GRP78与PERK解聚后随即寡聚化和自磷酸化。磷酸化的PERK激酶活性被激活，可以磷酸化eif2α51位的丝氨酸。eif2α磷酸化后,eif2α、(Met)-tRNA与GTP无法形成三元复合物始动蛋白质的合成，进而导致mRNA的翻译停止，蛋白质合成受阻滞[4]。

1.3 ATF6ATF6属于Ⅱ型内质网跨膜蛋白，在氨基端具有CREB/ATF bZIP 转录因子结构域。当内质网内积累未折叠蛋白后，ATF6被GRP78释放，转运至高尔基体内，被高尔基体膜蛋白酶S1P(site 1 protease)和S2P(site 2 protease)剪切，产生活性片段ATF6p50, ATF6p50随后进入细胞核，激活下游靶基因的表达。哺乳动物有两个ATF6同系物，ATF6α和ATF6β。在哺乳动物细胞中，ATF6α可以作为同源二聚体与ERSE结构域启动子区结合，反式激活绑定ER分子伴侣基因GRP78或p58IPK。此外，ATF6α也可以与XBP1异源二聚诱导ERAD元件——EDEM、HERP和HRD1的表达[4]。

2 UPR与肿瘤耐药

ERS发生后，UPR通路激活并参与调节多种细胞的病理活动。有研究报道，UPR与多种疾病，诸如代谢综合征[5]、神经系统变性疾病[6-8]、糖尿病、病毒感染性疾病、炎性反应和肿瘤[9]等疾病的发生发展密切相关。

在快速增殖的肿瘤组织中，肿瘤细胞糖代谢迅速， 实体瘤的生长速度大于其血液供应量， 因此，肿瘤一般处于缺糖、酸中毒及严重缺氧状态[10]。面对低氧、营养物质耗竭、酸中毒、未允许的基质细胞和细胞外基质交换等这些外界环境因素的改变，内质网通常不能表达正确折叠的蛋白，从而引发未折叠错误折叠蛋白在内质网腔内的蓄积，引发ERS，激活UPR[11]。UPR的激活在轻度ERS时保护细胞存活，并促进肿瘤细胞向更恶性的方向发展。因此，UPR可能也是调控肿瘤细胞发生耐药性的重要机制之一。

2.1 DNA修复异常引起DNA损伤是很多药物的作用靶点，很多细胞周期类抗肿瘤药物，例如，拓扑异构酶抑制剂——依托泊苷、多柔比星；5-氟尿嘧啶、顺铂等都会引起DNA损伤，从而诱导细胞凋亡。但同时，肿瘤细胞内也存在抗DNA损伤的修复机制，诸如碱基切除修复、核苷酸切除修复、DNA损伤修复、DNA双链断裂修复等。这些过程主要由核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等参与完成。当DNA损伤加剧时，这些酶蛋白的合成增加，从而引起DNA修复系统活性异常升高，使得肿瘤细胞获得耐药性。近年来的研究表明，UPR有可能通过调控DNA修复，促使肿瘤细胞产生耐药。Mann等[12]的研究发现，UPR可以增强小鼠成纤维细胞对依托泊苷的耐药性，并直接下调Topoisomerase II α蛋白水平，但是并不影响Topoisomerase IIα的mRNA水平。通过对UPR三条信号转导通路的进一步研究发现，IRE 1 通路激活可以在蛋白水平下调Topo IIα表达，但是并没有改变对依托泊苷的敏感性。说明Topo II α表达的下降可能并不是由于作为XBP-1的下游而受到调控，因为Topo IIα的转录并不受ERS影响。相反，PERK激活并没有改变Topo IIα的蛋白水平，但是该条通路确实在某种程度上对UPR诱导的对依托泊苷的药物敏感性降低发挥了重要作用。而ATF6通路与依托泊苷耐药无明显相关。Kim等[13]发现多柔比星可拮抗UPR诱导的细胞凋亡。当多柔比星与thapsigargin联合使用处理人乳腺癌MCF-7细胞时，细胞凋亡均少于与单用多柔比星或单用thapsigargin引起的细胞凋亡。此外，多柔比星还可下调ATF4及其下游靶基因CHOP蛋白的表达。但是，同为拓扑异构酶抑制剂的依托泊苷对UPR并无影响，说明多柔比星可能通过其他的通路调节UPR。Bobrovinkova-marjon等[14]的研究发现，PERK通路可以维持细胞处于还原态，因此可以降低氧化应激诱导产生的ROS引起的DNA损伤，从而维持肿瘤增殖和生长。当PERK干扰沉默后，氧化应激通路被激活，ROS在细胞内蓄积，细胞凋亡增加；而过表达PERK后，则细胞凋亡减少。

2.2 凋亡抑制诱导肿瘤细胞凋亡是化疗药物杀伤肿瘤细胞的重要机制之一，但肿瘤细胞内源性或获得性的凋亡通路阻断往往诱发肿瘤耐药,造成治疗失败。研究发现，Bcl/Bax蛋白、核转录因子(NF-κB)、p53基因、c-myc基因等都参与调控肿瘤细胞耐药。研究认为[15-16]，ERS对于细胞凋亡可能具有双向调节的作用。在ERS初期，细胞通过上调内质网应激伴侣蛋白的转录，阻止蛋白积累，短时抑制蛋白翻译，诱导G1期阻滞，激活大量的转录调控通路，增强细胞的降解能力。如果ERS持续长时间不能缓解，那么将激活相关级联通路，启动凋亡过程。在UPR调节的抗凋亡机制中，葡萄糖调节蛋白78——GRP78发挥了重要的调控作用[17-18]。研究发现，GRP78在多种肿瘤中高表达，并与肿瘤恶性程度、侵袭转移和化疗药物耐药性呈正相关。在乳腺癌中，GRP78只在恶性肿瘤中过表达，但不在良性乳腺病变中表达。这可能是在肿瘤组织中，由于血管分布不均、肿瘤细胞代谢迅速，而比正常细胞表现出更高的葡萄糖利用率有关。Ranganathan等[19]发现p38可以激活静止期细胞启动存活前机制。这是通过上调GRP78表达并激活PERK通路，使休眠细胞获得对毒性药物的抗性。此外，GRP78的上调也可以阻止Bax的激活，进而引起休眠细胞耐药。Jiang等[20]证实，GRP78可以与Caspase-4特异结合，而通过给予MEK/ERK通路靶向抑制剂U1026或MEK1 siRNA可以下调GRP78表达，从而诱导Caspase-4激活，启动Caspase-9、Caspase-3级联反应线粒体凋亡通路，最终导致细胞凋亡。此外，除了Caspase-4还有文献[21]报道称, GRP78可以与BIK结合，GRP78过表达可抑制BIK和雌激素——饥饿诱导的BAX激活；而通过siRNA干扰沉默GRP78可以增加乳腺癌细胞通过雌激素饥饿诱导的凋亡。此外，也有文献报道[22]，BAG3可通过直接与GRP78作用，增强DNA损伤剂对肿瘤细胞的杀伤作用。

2.3 自噬自噬是指真核细胞质内的大分子物质及细胞器被运送至溶酶体隔离并降解的过程。自噬是在正常细胞核病理状态细胞中普遍存在的生理机制，尤其是在细胞内和/或细胞外应激的情况下，例如缺氧、营养匮乏、蛋白质折叠、病原菌感染时，一方面细胞通过自噬获得可供循环利用的核苷、氨基酸等大分子物质及能量，维持细胞代谢平衡，另一方面还可选择性地清除某些细胞成分，尤其是受损或多余的过氧化物酶、内质网、线粒体及DNA，减少异常蛋白和细胞器的堆积，维持细胞内环境的稳定。自噬作为一种保护措施，维持细胞生存的同时，也与细胞的死亡密切相关。自噬与凋亡作为细胞启动程序性死亡的两个方面有着密切的联系。近年来的研究表明[23-25]，在多种肿瘤细胞中，化疗药物在诱导细胞凋亡的同时也能诱导细胞自噬，与凋亡必然导致肿瘤细胞死亡的作用不同，自噬的发生既能作为保护肿瘤细胞抑制凋亡的生存机制，也能与凋亡共同参与细胞死亡的诱导。而肿瘤发生的保护性自噬可能是细胞耐药性产生的潜在的重要机制之一。

近年的研究结果提示，ERS通过UPR通路诱导自噬，而真核细胞通过自噬可以将胞内的大分子物质及细胞器分解，以便重复利用。Li等[26]发现，GRP78是内质网应激诱导的自噬的重要因素。当SiRNA干扰沉默GRP78后，可自发激活UPR通路，并促进LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转换，但是由ERS诱导形成自噬小体的能力却被抑制。此外，PI3KC3抑制剂3-methyladenine (3-MA)，也可以同时抑制ERS诱导的自噬和UPR通路。Qu等[27]发现一种姜黄素单羰基类似物——B19，可通过抑制ERS诱导的自噬，减弱自噬对细胞的保护作用，从而增加ERS相关UPR通路诱导的凋亡。Höyer-Hoyer-Hansen等[28]的研究认为，PERK、IRE1和Ca2+浓度的增加是ERS诱导自噬的调节因子。

3 结语

肿瘤是当今世界最难治愈的疾病之一，而肿瘤细胞对于放化疗治疗产生的耐药性也是肿瘤临床治疗中急需解决的重大问题。上世纪ERS的概念提出后，科学家们对此领域进行了广泛的研究，对ERS和UPR反应的认识逐渐深入。目前研究认为，UPR的三条通路PERK、IRE1和ATF6调控细胞存活或凋亡的生物学功能不尽相同，进而对下游通路调节的生物学功能如DNA修复异常、凋亡抑制、自噬等的影响也存在差异。介导内质网应激与肿瘤耐药的机制并没有完全研究清楚。但是，随着研究的继续深入，针对UPR下游三条通路的靶向抑制剂的进一步研究与开发，将会有望成为治疗癌症放化疗耐药提供有效的靶点。

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Correlations of endoplasmic reticulum stress and cancer drug resistance

YAN Yuan-yuan, HE Miao, WEI Ming-jie

(DeptofPharmacology,SchoolofPharmacy,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110000,China)

Endoplasmic reticulum is an important organelle in eukaryotic cells. Endoplasmic reticulum stress(ERS) is usually triggered under cell hypoxia, carbohydrate undersupply or medical treatment. Now, present studies show that ERS could activate several cell signal pathways and the UPR pathway is most widely researched. When UPR activates cell signal pathway, it can regulate cancer drug resistance by involving with DNA damage repair, apoptotic suppression and autophagy.

endoplasmic reticulum stress; cancer drug resistance; UPR; ERS; apoptotic suppression; autophagy

时间：2015-3-16 15:41 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150316.1541.009.html

2014-10-31,

2014-12-16

国家自然科学基金资助项目(No 81373427)；辽宁省自然科学基金资助项目(No 2014021085)

颜媛媛(1987-)，女，博士，研究方向:分子肿瘤药理学, E-mail:yanyuanyuan1987@163.com; 魏敏杰(1963-)，女，博士，教授，博士生导师，研究方向：分子肿瘤药理学，E-mail:weimingjiecmu@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.04.005

A

1001-1978(2015)04-0461-04

R329.24；R329.25；R730.53