蛋白激酶在脊髓损伤中作用机制的研究进展

郭垠利 白 洁 (昆明理工大学医学院，云南 昆明 650500)

脊髓损伤(SCI)分为原发性脊髓损伤和继发性脊髓损伤〔1〕。炎性因子、活性氧、兴奋性毒性和代谢异常是导致继发性损伤的主要原因。正常或病理条件下，磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)/磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路在中枢神经系统(CNS)中扮演着不同的角色，两条通路的激活均能够诱导细胞结构和功能的改变。本文就PTEN/PI3K和MAPK信号通路在脊髓损伤中的作用及其分子机理进行综述。

1 PTEN和PI3K/Akt/mTOR信号通路

1.1 PTEN PTEN为第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源等位基因，高度表达在CNS成熟的神经元中〔2〕。PTEN定位于染色体10q23.3，编码一个含403个氨基酸，相对分子量为56 kDa的蛋白质，PTEN具有脂质磷酸酶以及蛋白磷酸酶双特异性活性〔3〕，在细胞增殖和神经细胞的生长中发挥重要作用。相关研究发现，抑制PTEN的活性可对神经元前体细胞产生保护作用，即敲除PTEN基因的神经元前体细胞对氧化应激损伤具有更强的抵抗作用。PTEN作为PI3K的拮抗剂，它限制了CNS中轴突的再生能力。有研究表明:在培养的海马神经元中过表达PTEN，Akt的水平下降，而在不表达PTEN的神经元中Akt的水平升高。同时PTEN过表达组的神经元在兴奋性谷氨酸诱导的神经元死亡实验中的死亡数量明显高于PTEN低表达或不表达组，说明PTEN可通过Akt依赖的信号途径调节神经元的存活和死亡〔4〕。此外，PTEN拮抗肽(PAPs)通过与PTEN相关的结构域结合从而抑制PTEN的活性，阻断PTEN的下游信号通路，促进轴突的生长。在背侧半切损伤的小鼠模型中，PAPs可抑制PTEN的功能，从而诱导脊髓前端皮质脊髓束(CST)增多。PTEN的缺失能够激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)，上调受损的视网膜神经节细胞(RGCs)和下行CST的神经细胞〔5〕。因此，CNS损伤后，下调PTEN的表达能够激活PI3K/Akt/mTOR等多种信号转导通路，促进轴突的再生并起到神经保护作用〔6〕。

1.2 PI3K/Akt信号通路 PI3K/Akt信号通路是重要的细胞存活信号通路，能够被多种神经营养因子(NGF)以及多种细胞因子受体激活从而抑制细胞凋亡，发挥神经保护作用。PI3K被上游信号激活后生成3，4二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)和3，4，5三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)。PIP3作为多用途的第二信使，将Akt和磷酸肌醇依赖性激酶(PDK)募集到胞膜区，PDK磷酸化后可活化下游Akt的The308和ser473，诱发后续的级联反应。活化的Akt由细胞膜释放，通过一系列的底物磷酸化活化可抑制下游靶蛋白，进而调节细胞增殖、分化、凋亡和侵袭。PI3K/Akt作用取决于PTEN，PTEN抑制PI3K的激酶活性，使PIP3去磷酸化而转化为PIP2，当细胞内PIP3含量降低，无法激活下游的Akt，则抑制了PI3K/Akt信号转导通路，进一步抑制细胞存活，促进细胞凋亡〔7〕。因此，下调PTEN的活性，上调PIP3的生成是PI3K通过Akt介导促存活的必要条件。有研究表明:在脊髓损伤的病灶区域内磷酸化的Akt表达下降，然而在周围的损伤半影区，神经元中磷酸化的Akt是上调的。围绕病灶中心周围的组织，Akt-Ser-437位点磷酸化水平在损伤8 h后达到最高峰并在受损24～48 h后逐渐消失〔8〕。由此可见，脊髓损伤后，磷酸化的Akt信号分子参与了细胞的凋亡与存活过程。此外有研究证实:当发生了SCI后，小鼠后肢的运动能力明显降低，神经营养因子3(NT-3)以及胰岛素生长因子(IGF-1)的表达都明显降低，PI3K，p-Akt/Akt的比值也明显降低，而活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)表达却增多。通过负荷跑台运动能够增强SCI小鼠后肢的运动能力，上调神经营养因子(NGF)，NT-3，IGF-1，抑制caspase-3的表达，增强运动功能〔9〕。由此可知，PI3K/Akt信号通路是促进神经细胞增殖，轴突再生的关键信号传导通路。

1.3 mTOR通路 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，由2 549个氨基酸残基组成，分子量为289 kD。其在感受营养信号，调节细胞生长与增殖中起着关键作用，同时参与基因转录、蛋白质翻译、核糖体合成和细胞凋亡等生物过程，是细胞在应激状态时的重要的调节分子，也是抑制细胞凋亡、抑制细胞自我吞噬的蛋白〔10〕。作为Akt的下游靶蛋白，Akt激活mTOR有两种方式:Akt可直接磷酸化mTOR的Ser2448位点，激活mTOR以及其下游途径，调控细胞生长与增殖;mTOR也可间接的被Akt激活，在正常情况下，结节性脑硬化复合物TSC1和TSC2形成的二聚体复合物是小GTP酶Rheb的抑制剂，而Rheb是mTOR活化所必需的刺激蛋白，因此TSC1/TSC2在正常情况下可抑制mTOR的功能，当Akt活化后，其可磷酸化TSC2，从而抑制了TSC1/TSC2复合物的形成，解除了对Rheb的抑制作用，使得mTOR被激活〔4〕。随着PTEN的敲除，活化的mTOR同样参与轴突的再生过程〔11〕。

mTOR主要下游效应器是核糖体蛋白p70S6激酶和4E结合蛋白1。4E结合蛋白1是翻译的负调控因子，当受到外界刺激时，mTOR磷酸化4E结合蛋白1，通过一系列反应之后促进翻译的起始。p70S6激酶是核糖体40S小亚基S6的蛋白激酶，mTOR通过磷酸化S6蛋白从而调控下游蛋白的翻译。因此，mTOR调控着翻译元件的生物合成，是蛋白质生物合成的基础〔12〕。近来有报道指出，脊髓损伤后的第10天及第31天，在灰质神经元中观察到了核糖体蛋白S6的上调〔13〕，这说明脊髓损伤后，活化的mTOR很可能参与到了促进存活以及抑制凋亡的信号通路中来。有研究表明:当敲除PTEN之后，激活了Akt/mTOR信号通路，从而促进了细胞的增殖以及CST的生长〔14〕。因此，通过抑制PTEN的活性或表达激活 PI3K/Akt/mTOR均可以起到促进细胞存活和抑制细胞凋亡的保护作用。然而，近来有研究证实:在SCI的小鼠模型中，使用雷帕霉素抑制mTOR的活性，可增强细胞自噬的活性，降低神经元的损伤程度、下调细胞凋亡。当mTOR的活性被抑制后，小鼠后肢的运动功能显著性增强。在SCI的急性损伤阶段，抑制mTOR信号通路能够起到神经保护作用并且弱化后期的继发性脊髓损伤〔15〕。在SCI中，mTOR信号通路的作用是双向的，不同的损伤阶段，mTOR扮演的功能作用是不同的。

2 MAPK信号通路

MAPK在神经系统内扮演许多重要的角色，包括促进细胞增殖、存活以及提高神经可塑性等。MAPK包括四个亚家族:细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、p38MAPK、c-jun N-末端蛋白激酶(JNKs)以及ERK5，每个亚族又可以分为几个不同的亚型:ERK 1/2亚型、JNK1、JNK2和JNK3。这些信号通路的机制已经被广泛的研究和报道过，例如MAPKs通过酪氨酸受体激酶、生长因子、炎症细胞因子或其他受体激活，可产生分子效应的级联反应〔16〕。

2.1 ERK信号通路 在MAPK家族中，ERK是最先被发现并且研究最多的成员。ERK包括两种异构体，分别是ERK1和ERK2，分子量分别为44 kDa和42 kDa。ERK信号通路是多数生长因子、细胞因子调控细胞增殖的重要途径，参与细胞周期的调控。ERK的分子机制都已被深入的探讨过〔17〕，各种基因的突变都可引起ERK信号传导的失调，可与多种神经系统发育异常相关，包括X连锁智力迟钝、努南综合征和多发性神经纤维瘤病1 型等〔18〕。

在神经创伤的研究中，对ERK的神经保护作用和促进细胞凋亡作用一直存在分歧。有研究表明:在中枢神经系统遭受损伤后，多种细胞类型中均有磷酸化 ERK的表达〔19〕。通过NGF以及ERK激酶的治疗，过表达的ERK能够促进神经细胞的存活以及轴突的生长。磷酸化的ERK对大脑缺血性死亡还可以起到神经保护作用〔16〕，在脊髓损伤后，活化的ERK可介导脑源性神经营养因子(BDNF)的上调并且下调有害的神经生长因子前体，发挥神经保护作用。ERK能够通过胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)介导轴突再生长，从而促使神经细胞粘着分子(NCAM)发挥修复神经系统 SCI的作用〔20，21〕。因此，ERK信号的上调可以发挥神经保护、修复以及功能恢复等作用。

另一方面，活化的ERK对中枢神经系统也会有负面作用〔21〕。SCI后，抑制 ERK1/2 的表达能够阻止细胞凋亡〔22〕。在中枢神经系统中，活化的ERK与疼痛信号也具有相关性〔23〕，ERK参与疼痛的超敏反应主要通过与上调NMDA受体(NMDA)的亚单位未实现〔24〕。有研究表明:在体内，ERK1的缺失对于脊柱的疼痛几乎不产生任何影响，然而活化的ERK2上调在疼痛反应的机制中却起了很大的作用〔25〕。这说明，每个ERK的异构体在不同的刺激条件下可能扮演不同的角色。在SCI后，利用RNAi技术敲除蛛网膜下腔以及椎管内的的ERK2蛋白，有助于机体功能的恢复。在脊髓损伤1 d后，磷酸化的ERK 1/2显著上调，这种增高现象可持续3 d〔26〕。说明活化的ERK在神经保护作用十分重要，在不同的损伤情况下ERK发挥不同的作用。

2.2 p38和JNK信号 p38和JNK信号通路通常与细胞的炎性反应及应激反应相关，同属于应激激活的蛋白激酶。p38由360个氨基酸残基组成，分子量为38 kD。p38信号通路是MAPK通路的一个重要分支，它在炎症、细胞应激、凋亡、细胞周期和生长等多种生理和病理过程中起重要作用。p38MAPK可随着损伤后的应激反应而被激活，激活的p38 MAPK通过下游的许多效应器完成炎性应答〔27〕。有研究表明:在受损的脊髓神经元、星形胶质细胞和巨噬细胞内，p38MAPK的表达上调〔28〕。活化的p38可蛋白也可以促进细胞的增殖和存活。有研究表明:各类应激源激活p38MAPK之后，活化的p38将MK2磷酸化，磷酸化的MK2作为活性形式与结合于热休克蛋白27(Hsp27)的Akt接近，将Akt丝氨酸473位点磷酸化，激活Akt促存活通路，同时磷酸化的MK2也可将Hsp27磷酸化，使之解聚为分子量较小的多聚体或者单体磷酸化Hsp27，磷酸化的Hsp27作为一类小分子热休克蛋白，在多种应激事件之后，常作为保护机制而迅速升高，抵御应激造成的机体损伤，减少凋亡的发生〔28〕。同时有研究表明:在坐骨神经的慢性压迫性损伤(CCI)中，通过阻断p38MAPK的活性能够有效地弱化神经性疼痛〔29〕，由此可见，p38与脊髓神经损伤关系密切。

JNK位于胞质，是分子质量为54 kD的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通常参与炎症和细胞死亡。有研究表明，JNK通路的激活与多种系统的促凋亡作用有关〔30〕。在脊髓损伤中，活化的JNK增强轴突变性并且降低机体功能的修复能力〔31〕。虽然JNK/SAPK信号传递途径的激活与细胞凋亡密切相关，但是有些研究表明，在某些类型的应激刺激下，激活JNK/SAPK并不导致细胞凋亡，都可能与细胞增殖反应有关。

3 总结

SCI一直以来都是难以攻克的难题，虽然目前在临床上，我们已经找到了治疗的手段能够可有助于SCI的恢复，然而对于彻底根治SCI还有待提高。本篇综述了在脊髓损伤中，PTEN/PI3K/AKTmTOR以及MAPK信号通路，以及这些信号通路在脊髓损伤后相关的修复以及诱导继发性损伤的作用机理，为研究创伤性中枢神经系统产生的继发性损伤以及组织病变提供了理论依据。

1 Gunda V，Bucur O，Varnau J，et al．Blocks to thyroid cancer cell apoptosis can be overcome by inhibition of the MAPK and PI3K/AKT pathways〔J〕．Cell Death Dis，2014;5:e1104．

2 Govatati S，Kodati VL，Deenadayal M，et al．Mutations in the PTEN tumor gene and risk of endometriosis:a case-control study〔J〕．Hum Reprod，2014;29(2):324-36．

3 Tabares-Seisdedos R，Dumont N，Baudot A，et al．No paradox，no progress:inverse cancer comorbidity in people with other complex diseases〔J〕．Lancet Oncol，2011;12(6):604-8．

4 Shi GD，OuYang YP，Shi JG，et al．PTEN deletion prevents ischemic brain injury by activating the mTOR signaling pathway〔J〕．Biochem Biophys Res Commun，2011;404(4):941-5．

5 Ohtake Y，Park D，Abdul-Muneer P，et al．The effect of systemic PTEN antagonist peptides on axon growth and functional recovery after spinal cord injury〔J〕．Biomaterials，2014;35(16):4610-26．

6 Chiu CT，Chuang DM.Molecular actions and therapeutic potential of lithium in preclinical and clinical studies of CNS disorders〔J〕．Pharmacol T-her，2010;128(2):281-304．

7 Kay JC，Xia CM，Liu M，et al．Endogenous PI3K/Akt and NMDAR act independently in the regulation of CREB activity in lumbosacral spinal cord in cystitis〔J〕．Exp Neurol，2013;250:366-75．

8 Walker CL，Walker MJ，Liu NK，et al．Systemic bisperoxovanadium activates Akt/mTOR，reduces autophagy，and enhances recovery following cervical spinal cord injury〔J〕．PLoS One，2012;7(1):e30012．

9 Jung SY，Kim DY，Yune TY，et al．Treadmill exercise reduces spinal cord injury?induced apoptosis by activating the PI3K/Akt pathway in rats〔J〕．Exp Therap Med，2014;7(3):587-93．

10 Laplante M，Sabatini DM.mTOR signaling in growth control and disease〔J〕．Cell，2012;149(2):274-93．

11 Tolkovsky AM.Is PTEN hyperactivity behind poor regeneration in diabetic neuropathy〔J〕?Brain，2014;137(Pt 4):977-8．

12 Clemens MJ，Elia A，Morley SJ.Requirement for the eIF4E binding proteins for the synergistic down-regulation of protein synthesis by hypertonic conditions and mTOR inhibition〔J〕．PLoS One，2013;8(8):e71138．

13 Liu G，Detloff MR，Miller KN，et al．Exercise modulates microRNAs that affect the PTEN/mTOR pathway in rats after spinal cord injury〔J〕．Exp Neurol，2012;233(1):447-56．

14 Park KK，Liu K，Hu Y，et al．PTEN/mTOR and axon regeneration〔J〕．Exp Neurol，2010;223(1):45-50．

15 Kanno H，Ozawa H，Sekiguchi A，et al．The role of mTOR signaling pathway in spinal cord injury〔J〕．Cell Cycle，2012;11(17):3175-9．

16 Yang SH，Sharrocks AD，Whitmarsh AJ.MAP kinase signalling cascades and transcriptional regulation〔J〕．Gene，2013;513(1):1-13．

17 Suzuki I，Tsuboi Y，Shinoda M，et al．Involvement of ERK phosphorylation of trigeminal spinal subnucleus caudalis neurons in thermal hypersensitivity in rats with infraorbital nerve injury〔J〕．PLoS One，2013;8(2):e57278．

18 Samuels IS，Saitta SC，Landreth GE.MAP＇ing CNS development and cognition:an ERKsome process〔J〕．Neuron，2009;61(2):160-7．

19 Zhu P，Zhan L，Zhu T，et al．The roles of p38 MAPK/MSK1 signaling pathway in the neuroprotection of hypoxic postconditioning against transient global cerebral ischemia in adult rats〔J〕．Mol Neurobiol，2014;49(3):1338-49．

20 Awad BI，Carmody MA，Steinmetz MP.Potential role of growth factors in the management of spinal cord injury〔J〕．World Neurosurg，2015;83(1):120-31．

21 Zhao Z，Liu N，Huang J，et al．Inhibition of cPLA2 activation by Ginkgo biloba extract protects spinal cord neurons from glutamate excitotoxicity and oxidative stress-induced cell death〔J〕．J Neurochem，2011;116(6):1057-65．

22 Zhao Y，Luo P，Guo Q，et al．Interactions between SIRT1 and MAPK/ERK regulate neuronal apoptosis induced by traumatic brain injury in vitro and in vivo〔J〕．Exp Neurol，2012;237(2):489-98．

23 Acosta-Rua AJ，Cannon RL，Yezierski RP，et al．Sex differences ineffects of excitotoxic spinal injury on below-level pain sensitivity〔J〕．Brain Res，2011;1419:85-96．

24 Wang H，Li Y，Dun L，et al．Antinociceptive effects of oxymatrine from Sophora flavescens，through regulation of NR2B-containing NMDA receptor-ERK/CREB signaling in a mice model of neuropathic pain〔J〕．Phytomedicine，2013;20(11):1039-45．

25 Alter BJ，Zhao C，Karim F，et al．Genetic targeting of ERK1 suggests a predominant role for ERK2 in murine pain models〔J〕．J Neurosci，2010;30(34):11537-47．

26 Moens U，Kostenko S，Sveinbjornsson B.The Role of Mitogen-Activated Protein Kinase-Activated Protein Kinases(MAPKAPKs)in inflammation〔J〕．Genes(Basel)，2013;4(2):101-33．

27 Ghasemlou N，Lopez-Vales R，Lachance C，et al．Mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 2(MK2)contributes to secondary damage after spinal cord injury〔J〕．J Neurosci，2010;30(41):13750-9．

28 Shi GX，Cai W，Andres DA.Rit subfamily small GTPases:regulators in neuronal differentiation and survival〔J〕．Cell Signal，2013;25(10):2060-8．

29 Zhou C，Shi X，Huang H，et al．Montelukast attenuates neuropathic pain through inhibiting p38 mitogen-activated protein kinase and nuclear factor-kappa B in a rat model of chronic constriction injury〔J〕．Anesth Analg，2014;118(5):1090-6．

30 Wang YC，Xia QJ，Ba YC，et al．Transplantation of olfactory ensheathing cells promotes the recovery of neurological functions in rats with traumatic brain injury associated with downregulation of Bad〔J〕．Cytotherapy，2014;16(7):1000-10．

31 Yoshimura K，Ueno M，Lee S，et al．c-Jun N-terminal kinase induces axonal degeneration and limits motor recovery after spinal cord injury in mice〔J〕．Neurosci Res，2011;71(3):266-77．