侵袭性曲霉菌感染的诊断方法及临床应用

侵袭性曲霉菌感染的诊断方法及临床应用

王立朋秦榛1夏云

(重庆医科大学附属第一医院检验科，重庆400016)

关键词〔〕G试验；GM试验；聚合酶链式反应；核酸序列依赖扩增；曲霉菌

中图分类号〔〕R44〔

基金项目：国家临床重点专科建设项目经费资助〔财社2010(305)号〕

通讯作者：夏云(1966-)，男，主任技师，硕士生导师，主要从事感染性疾病的分子诊断研究。

1山东中医药大学附属医院检验科

第一作者：王立朋(1989-)，男，检验技师，硕士，主要从事感染性疾病的分子诊断研究。

近年来由于肿瘤化疗，造血干细胞移植术、实体器官移植术后应用免疫抑制剂及糖皮质激素等药物〔1〕，临床上出现越来越多的免疫力低下的老年病人并使得侵袭性曲霉菌感染的发病率呈上升趋势，免疫力低下的老年病人发生侵袭性曲霉菌感染后的死亡率也一直居高不下。在侵袭性真菌感染中，曲霉菌所导致的感染占了很大的比例，2000 ～ 2008年美国一肿瘤中心发生侵袭性曲霉菌感染的比例达58%〔2，3〕。抽样调查显示，空气中存在的孢子0.1%～22%为曲霉属孢子〔4〕。曲霉菌感染可以导致人类多种疾病，比如侵袭性曲霉病，侵袭性肺曲霉病，过敏性支气管曲霉病，过敏性真菌鼻窦炎等。除了曲霉病以外，曲霉菌还可以导致其他多种疾病，比如曲霉肿、鼻窦炎、过敏性支气管曲霉病等〔5〕。研究表明，某些曲霉病也可发生于一些与上述高危因素侵袭性曲霉菌感染的诊断方法及临床应用无关的病人中，如肺曲霉病可继发于慢性阻塞性肺病(COPD)、非真菌性肺炎等〔6〕。早期精确的诊断结果是及早开展抗霉菌治疗的前提。而及时、正确的抗霉菌治疗无疑能够显著改善临床预后，降低死亡率。

1物理诊断

这种传统的诊断方法主要是通过问诊的手段获取病人的临床症状及体征。但由于侵袭性曲霉菌感染所带来的临床症状和体征缺乏特异性，并不能同其他非真菌病原体所导致的感染区分开来。并且一些重病患者往往不能或是难以准确地表达出自身的感受。根据一些临床〔6〕经验，长期耐抗生素性的发热、咳嗽并伴有肋膜炎样的疼痛对于侵袭性曲霉菌感染具有提示作用。

2影像学诊断

影像学对于侵袭性曲霉菌感染的诊断最具有价值的是高分辨率CT扫描检查，尤其是对于肺曲霉病的诊断具有较高的参考价值。侵袭性肺曲霉病CT首次检查的早期多表现为大小不等的结节，7～14 d时，结节病变的数量和大小均表现出增加趋势〔7〕。肺部发生曲霉菌感染早期的CT扫描亦可出现光环征，随着感染病程的发展，晚期可以出现新月征。CT检查的缺点在于光环征等特征性影像出现的时间比较短暂，75%的光环征1 w以内就会消失〔2〕。而且并非所有曲霉菌感染病患都能出现特征性的CT影像；此外出现这两种影像也有可能是由于其他病原微生物感染亦或是一些非感染病因引起的〔8〕。故对于CT扫描影像的提示价值应当慎重评估。

3实验诊断

3.1显微镜检查显微镜检查主要包括标本直接显微镜检查和组织病理学检查,都是以形态学特点为基础来对病原微生物进行诊断。曲霉菌镜检呈现玻璃样透明的菌丝，但是曲霉菌菌丝结构特点的特异性并不突出，其他种类相似的真菌如青霉菌亦可呈现类似的镜下特点。另一方面，组织病理学检查报告中经常会出现曲霉样形态学特点等描述性的诊断结果，这对于显微镜下形态学特点与曲霉菌类似但又不是曲霉菌的一些病原微生物的诊断带来困难。由于鉴别诊断难以进行，误诊的出现几乎不可避免。若是发生误诊的两种病原微生物的治疗方案相差较大，就会严重影响治疗效果，从而进一步导致预后不良。此外，检查者的主观因素也有可能对诊断结论产生影响。

3.2病原微生物培养标本病原微生物的培养结果或是组织病理学诊断结论依然是侵袭性曲霉菌感染确诊的“金标准”，这是曲霉菌感染的诊断基础〔3〕。曲霉菌的培养适用于各种标本类型并且目前已经成熟的应用于临床，尤其是来源于无菌部位的标本培养结果阳性具有确诊价值。但是曲霉菌的培养与普通的细菌培养相比往往耗时更长，而且敏感性并不够高，侵袭性曲霉菌感染早期培养结果通常是阴性。此外，由于曲霉菌是机会致病菌，从有菌区获取的阳性培养结果并不能明确是由于定植的正常菌群或是侵袭性感染所致。

近年来，培养技术的改进能够获取比以前准确性更好的结果，并且在一定程度上可以缩短培养时间。但是，获取培养或是组织病理检查的标本往往要通过侵入性的检查手段，而另一方面侵袭性曲霉菌感染通常继发于免疫功能低下病人，这类病人很大一部分病情较重，此时侵入性检查往往不被接受，这在一定程度上又限制了这两种传统方法的应用。

3.3临床免疫学诊断临床免疫学诊断主要包括曲霉菌抗原检测及机体产生的抗体检测。由于侵袭性曲霉菌感染者多伴有免疫缺陷，免疫功能受到削弱，机体可能并不能进行有效的免疫应答产生抗体，抗体的检测对侵袭性曲霉菌感染的诊断意义不大，尤其是对于中性粒细胞减少病人的诊断价值更小，故临床应用的重点在于曲霉菌抗原检测。曲霉菌抗原检测方法主要是(1，3)-β-D-葡聚糖(G)试验和血清半乳甘露聚糖(GM)试验。

3.3.1G试验G试验检测的是真菌细胞壁的成分：(1,3)-β-D-葡聚糖。人体吞噬细胞吞噬真菌后能够持续释放该物质使得其在体液中的含量增高。(1,3)-β-D-葡聚糖可特异性激活鲎变形细胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固，故称G试验。该试验适用于曲霉菌感染的诊断，但是并不能明确菌种。G试验检测结果阳性是欧洲癌症研究和治疗组织/侵袭性真菌感染协作组和美国国立变态反应和感染病研究院真菌研究组(EORTC/MSG)的一个真菌感染间接标准，并且已经被美国食品药品管理局(FDA)批准用于血清样本的检测。G试验能够检测出0.5 ng/ml的(1,3)-β-D-葡聚糖，对于急性髓性白血病(AML)和骨髓增生异常综合征(MDS)病人来说有很高的准确度(敏感度97%，特异度93%)。G试验的关键点在于标准化操作及临界值的确定〔7〕。G试验的缺点在于假阳性的存在。假阳性结果出现的原因主要包括以下几个方面：血液透析和腹膜透析过程中使用纤维素膜；病人治疗过程中输入白蛋白、免疫球蛋白及凝血因子；病人服用β内酰胺类抗生素；链球菌引起的败血症；外科手术中使用的棉纱等。在评估G试验阳性结果时，应把可能导致假阳性结果的因素排除在外。

3.3.2GM试验主要用于侵袭性曲霉菌感染的诊断。发生曲霉菌感染时，菌丝生长时半乳甘露聚糖可以从菌丝顶端释放入血，且释放量与血液中的菌量呈正比，故可以间接反映感染程度。研究显示，循环性半乳甘露聚糖敏感性在70%～90%，阳性测试结果的特异性也在70%～90%〔9〕。另有报道显示，血清半乳甘露聚糖的检测比临床症状或是影像学检查异常的出现早5～8 d。结合很有可能发生侵袭性霉菌感染的病例，分析的特异度为89%～93%，敏感度61%～71%。阳性预测值较低而阴性预测值很高，故可用于排除侵袭性霉菌感染发生的可能〔10〕。值得注意的是，血清半乳甘露聚糖连续两次结果阳性比单独一次的结果阳性具有更大的临床意义，连续两次结果阳性作为诊断标准能提供更好的准确度。为了提高诊断结果的可靠性，可以对曲霉菌感染的高危病患进行连续监测。

与G试验相似，GM试验亦有假阳性结果的存在。引起假阳性结果的原因主要包括病人服用哌拉西林-他唑巴坦；病人食用的谷类食物含有GM抗原；定植的曲霉菌由于种种原因进入血液循环。在对检测结果进行评估时，应将上述因素排除在外。总体来说，临床免疫学诊断方法在排除影响结果的因素后，具有较大的应用价值。除血清外，其他标本类型如支气管肺泡灌洗液等也可用于检测。对于呼吸系统可能存在的曲霉菌感染，支气管肺泡灌洗液的抗原检查要比血清抗原检查及支气管肺泡灌洗液标本分离培养、活组织病理切片检查的敏感性更高〔11〕。

3.4分子生物学诊断聚合酶链反应(PCR)分子生物学技术用于曲霉菌感染的诊断主要是及以PCR为基础的检测体系。PCR检测体系的靶点主要包括曲霉菌一些基因位点的保守序列或是线粒体DNA片段。首先将标本中可能存在的曲霉菌DNA提取出来，利用实时荧光定量PCR将其扩增得出初始标本中的曲霉菌DNA拷贝数或是利用传统PCR将其扩增后，利用其他分析方法对扩增后产物进行分析，从而得到初始标本中的曲霉菌的量和种类等相关信息。

PCR检测曲霉菌感染近年来得到很多研究支持，Suarez等〔12〕应用实时荧光定量PCR技术以编码曲霉菌28S rRNA的多拷贝基因片段为靶点进行检测,发现荧光定量PCR比半乳甘露聚糖检测具有更好的灵敏度，实现了曲霉菌感染的进一步的提前诊断；O'Sullivan等〔13〕应用实时定量PCR技术，以编码ITS1与ITS2保守序列及5.8 S rRNA的基因片段为靶点，对支气管肺泡灌洗液标本进行检测，获得了比培养更好的灵敏度；Schabereiter-Gurtner等〔14〕以ITS2区域为靶点，设计具有属特异性的引物并结合有种特异性的探针，以PCR扩增过程中出现的特征性的最高融解温度，将临床标本最常分离到的曲霉菌属和念珠菌属中的11个种群筛选并区别开来。

通过PCR发现阳性结果比CT扫描平均早1 w，比组织病理学检查早2～3 w〔10〕。以PCR为基础的检测体系用于检测曲霉菌感染的灵敏度由于靶点、标本类型的不同可能会有所差异，但报道显示总体的灵敏度较高：Francesconi等〔15〕应用实时定量PCR对支气管肺泡灌洗液标本进行检测，并与半乳甘露聚糖检测以及培养的方法进行对比，发现前两者均比培养的方法更加敏感；Scotter等〔16〕报道实时荧光定量PCR检测曲霉菌的检测下限为100 CFU，将PCR与酶联免疫吸附测定(ELISA)技术结合以后，检测下限可以提高到10 CFU；Bansod等〔17〕用PCR以18 S rRNA基因为靶点检测烟曲霉菌的检测下限达10 fg。此外，PCR检测的特异度很高，Rantakokko-Jalava等〔18〕研究显示PCR用于检测烟曲霉菌的特异度可达93%。

虽然基于PCR技术的诊断方法灵敏度和特异度均比较理想，但其缺点在于污染问题和假阳性结果的出现。由于空气中可能存在的霉菌孢子可能会对反应体系带来污染，因此操作时应在超净台或是生物安全柜中进行。此外，此类方法仍处于研发阶段，尚未出台达成共识的标准化操作规程，进入临床应用仍需大量研究的数据及标准操作流程。

近年来，除PCR以外，其他可用于侵袭性曲霉菌感染诊断的新方法不断涌现。如Zhao等〔19〕运用核酸序列依赖扩增(NASBA)结合分子信标(MB)检测支气管肺泡灌洗液标本中的曲霉菌感染，检测下限<0.1 CFU。核酸序列依赖扩增技术相比较PCR最大的不同点在于整个扩增过程在恒温下进行，不需要高温变性步骤，即使有外来的DNA也不会发生解链，再加上引物的特异识别，可有效避免PCR所存在的污染及假阳性问题；结合分子信标构成检测体系，由于分子信标也具有一定的特异识别能力，故使得特异性得以进一步的提高，具有较好的临床应用前景。

此外，荧光原位杂交(FISH)可以特异性地检测出组织石蜡切片中的曲霉菌，设计不同菌属探针进行靶DNA杂交可以快速检测各种临床标本中的真菌感染,根据不同种属的曲霉菌设计出靶DNA序列特异性探针，明确曲霉菌种，以期早期病原学诊断侵袭性真菌感染(IFI)，达到抢先治疗的目的〔20〕。Hsiao等〔21〕应用DNA芯片用于诊断霉菌感染的诊断，灵敏度和特异度分别达到98.3%和98.1%。斑点杂交法具有快速敏感特异的优点对烟曲霉菌感染的快速诊断亦有重要意义〔22〕。结合目前的临床实际状况，临床医师怀疑免疫低下老年病人发生侵袭性曲霉菌感染时，应当及时多部位采集标本，并且尽可能采集多种类型的标本(如血液、支气管肺泡灌洗液、胸腹水等)送检，并且对于曲霉菌感染的高危病患可以1 w内多次送检以实现对于感染状况的连续监测。如若条件允许，可以再辅以高分辨率CT扫描检查(尤其是胸腔可能发生的真菌感染)。联合多种方法可尽早实现对于曲霉菌感染的准确诊断。对于免疫力低下病人可在合适的时机采用预防性的抗曲霉菌药物，在明确的诊断结果反馈以后再对感染的治疗策略进行调整。

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〔2013-09-05修回〕

(编辑安冉冉/张慧)