羊传染性脓疱病毒抗干扰素基因(VIR)研究进展

王玲玲，刘永杰，郑海学，张克山，刘湘涛

羊传染性脓疱病毒抗干扰素基因(VIR)研究进展

王玲玲，刘永杰，郑海学，张克山，刘湘涛

羊传染性脓疱病毒(ORFV)是痘病毒科副痘病毒属的成员之一，引起严重的人兽共患传染病。该病毒基因组全长约134～139 kb，编码130多个蛋白，抗干扰素基因是ORFV编码的具有拮抗宿主干扰素功能的蛋白，在ORFV突破宿主免疫屏障过程中有重要作用。本文就抗干扰素基因的研究进展作一综述。

羊传染性脓疱病毒；VIR基因；研究进展

羊传染性脓疱(俗称羊口疮)是由羊传染性脓疱病毒(Orf virus，ORFV)感染引起的严重的人兽共患传染病。ORFV含线性双股DNA，有囊膜，属于痘病毒科(Poxviridae)，副痘病毒属(Parapoxvirus)，可感染山羊、绵羊，也可以感染人，通常是急性感染，引起口唇、舌、鼻、乳房等部位皮肤与黏膜形成水疱、丘疹、脓疱、溃疡，然后结成疣状痂[1]。ORFV具有嗜上皮性，皮肤破损处容易感染并在上皮细胞中增殖。该病为自限性感染，通常患病动物1～2个月就会康复[2]。患病动物一般死亡率不高，但如果羔羊感染后又继发感染或混合感染其他病毒或细菌则死亡率较高，人感染后主要表现为指间、手背以及手臂出现疱疹和破溃[3-4]。该病在世界范围内广泛流行，我国湖北、山东、贵州、福建、黑龙江、新疆等多个省份均有该病发生，不仅给养羊业造成了严重的经济损失，还严重威胁人民的身体健康。

ORFV基因组为线性双股DNA，全长约为134～139 kb，不同毒株之间基因组长度有10～25 kb的差异。基因组共有16个开放阅读框，编码大约130个基因[5]。许多痘病毒基因组富含AT，而ORFV等副痘病毒属的一些病毒则G+C含量较高，约64%[6]。ORFV基因组中间有一个较长的中心编码区，主要编码一些与病毒复制和装配或病毒形态有关的蛋白，如RNA聚合酶等。中心编码区以外两端编码一些病毒复制非必需基因，如抗干扰素基因(VIR)，IL-10基因(vIL-10)，血管内皮生长因子(VEGF)，趋化因子结合蛋白(CBP)，锚蛋白(ANK)，脱氧尿苷焦磷酸酶 (dUTPase) ，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)抑制因子(GIF)，这些基因与ORFV宿主嗜性、致病力及免疫逃避有关[7-9]。基因组两端各有3 kb左右的反向末端重复序列(inverted terminal repeat，ITR)，两端有封闭的发夹结构。ORFV基因组相对保守，不同毒株之间同源性较高，但两端非保守区频繁突变，同一物种的不同毒株也有较高的变异率[10]，ORFV细胞培养时连续传代常发现ITRs有基因重排现象，这种基因重排和缺失会导致病毒毒力改变[11]。

VIR是ORFV感染早期表达的主要毒力因子之一，参与拮抗宿主免疫应答，能在早期感染时为病毒的复制和增殖创造有利条件[12]。本文就ORFV编码的VIR的结构和功能等方面进行综述，以期阐明VIR的研究现状。

1 VIR的结构与特征

VIR基因位于ORFV基因组左侧距离左端20 kb的位置，VIR基因比较保守，常用作比较不同毒株间的亲缘关系，构建系统发育树[13-14]。在VIR基因起始密码子上游有痘病毒保守的启动子以及转录控制元件，并在TAA终止密码子之后有一个痘病毒保守的早期基因转录终止序列T5NT。抑制病毒中晚期表达后，VIR基因仍然表达证实了该基因在感染早期表达[14]。VIR基因与牛痘病毒(Vaccine virus, VACV)的抗干扰素基因E3L同源，二者核苷酸序列一致性为44%，其产物的氨基酸序列有31%的一致性，相似性为53%[15-16]。VACV的E3L蛋白C端结构域为ds-RNA结合结构域，是VACV抗干扰素活性以及细胞培养时适应广阔的宿主范围所必需的[17-18]，N端为Z-DNA结合结构域，与E3L蛋白核定位有关，两个结构域由一段酸性、胰蛋白酶敏感的序列连接起来[19]，两个结构域均为该基因致病所必需的[20]。结构域预测表明VIR蛋白也是由N端的Z-DNA结合结构域和C端的ds-RNA结合结构域构成。

2 VIR编码两种蛋白

VIR基因在宿主细胞内以及构建的载体均能够表达出两种蛋白质VIR以及shVIR，大小分别约为25 kDa和12 kDa[21]。后者的出现是因为mRNA进行翻译时，将起始密码子下游的甲硫氨酸密码子作为了起始密码子，跳过了多肽链氨基端的一部分序列。将下游的AUG密码子替换为AUU则不能产生shVIR。VIR与shVIR的许多特性比较相似，都可以结合dsRNA，抑制PKR活性，抑制干扰素免疫应答等。二者在细胞中的分布不同， shVIR由于缺少核定位序列，主要分布在细胞质中 ，而VIR主要分布在细胞核中。并且在小鼠模型中，只表达shVIR的重组ORFV毒力相对较弱，说明VIR的N端结构域与该基因的致病性有关[22]。

3 VIR抑制宿主干扰素应答

ORFV在细胞培养时表现出拮抗干扰素的活性，并且能够保护其他病毒在含有I型和II型干扰素的培养液中增殖，ORFV的这一活性与VIR基因有关。将VIR基因的表达产物加入细胞上清能保护病毒在含IFN的培养液中增殖。病毒复制过程中产生的dsRNAs是诱导抗病毒免疫应答中重要的病原相关分子模式(PAMP)，蛋白激酶R(protein kinase R，PKR)是干扰素信号通路下游重要的蛋白质[23-24]。VIR蛋白结合dsRNA以及PKR的特性在ORFV抑制干扰素应答中发挥重要作用。

3.1 双链RNA结合活性 Haig等用大肠杆菌表达的VIR融合蛋白进行电泳迁移率实验证实VIR蛋白的dsRNA结合活性[25]。许多ds-RNA结合蛋白有5个保守的氨基酸残基F148, S166, K167, R168, K171，是结合dsRNA所必需的。这5个氨基酸残基形成一个亲水的平面作用于dsRNA的小沟[26-27]。VIR蛋白的dsRNA结合结构域也存在这5个保守残基。VIR蛋白相比牛痘病毒E3L蛋白有3个突变，E3L中的Q127, P142和 A175，在VIR中对应的是 M119, E135, 和 C168，这3个突变改变了VIR蛋白dsRNA结合结构域疏水中心的稳定性，使VIR结合dsRNA的能力相对其他的dsRNA结合蛋白减弱[21]。

3.2 抑制PKR活性 VIR能够抑制PKR活性，抑制PKR的自身磷酸化以及对翻译起始因子eIF-2α亚基的磷酸化。正常情况下，PKR在干扰素的诱导作用下，与病毒dsRNA结合后发生自我磷酸化，并使翻译起始因子eIF-2的α链磷酸化。磷酸化的eIF-2不能发挥其正常作用，病毒蛋白以及细胞中的蛋白质无法合成，从而阻止病毒复制[28]。PKR还与细胞凋亡有关，VIR蛋白抑制PKR活性从而使病毒得以在细胞内复制[29]。由于PKR具有dsRNA依赖性，VIR基因的产物具有结合dsRNA的活性，能够与PKR竞争性结合dsRNA，VIR抑制PKR活性曾被认为是该蛋白结合dsRNA从而阻断了PKR的激活导致的[30]。Yeu-yang Tseng等通过免疫共沉淀的方法证明了VIR以及shVIR均能够直接与PKR结合抑制其功能的发挥[22]。

4 VIR可取代VACV的E3L基因发挥作用

ORFV的VIR与同源的VACV蛋白E3L的氨基酸序列相似性只有53%，有研究将VIR基因与缺失E3L基因的VACV重组，VIR基因插入在E3L基因的位置，VIR基因能够替代E3L的作用，重组病毒能够抑制干扰素，适应原来的宿主范围，与野生型的VACV一样复制增殖，但重组病毒的毒力相比野生型减弱，使重组病毒毒力减弱的原因主要是C端结构域的改变[21]。VACV可以用作重组疫苗的载体以及抗癌治疗[31-32]，插入VIR基因构建的重组病毒，在组织细胞培养时能够有效增殖且毒力相对较弱，有潜力发展成为新一代的重组疫苗载体。

5 展 望

病毒复制过程中产生的dsRNAs是诱导宿主抗病毒免疫应答中重要的病原相关分子模式(PAMP)。许多病毒抵抗宿主抗病毒免疫的方式便是产生dsRNA结合蛋白，如痘病毒的E3蛋白家族、流感病毒的NS1以及埃博拉病毒的V35蛋白[33-34]。结合并阻断病毒的dsRNA PAMP从而抑制相关的抗病毒免疫应答是目前发现的许多病毒dsRNA结合蛋白的作用方式。VIR编码的蛋白质通过结合并阻断病毒的dsRNA PAMP，结合并抑制干扰素信号通路中的PKR激酶，作为ORFV逃避宿主免疫的重要部分，为病毒在宿主细胞内复制赢得时机。进一步深入研究VIR的功能，对于全面认识ORFV的致病及免疫逃避的分子机制有重要作用。

[1]Bodilsen J, Leth S. Orf parapoxvirus can infect humans after relevant exposure[J]. Ugeskr Laeger, 2013, 175(16): 1121-1122.

[2]Zhao K, Song D, He W, et al. Identification and phylogenetic analysis of an Orf virus isolated from an outbreak in sheep in the Jilin province of China[J]. Vet Microbiol, 2010, 142(3/4): 408-415. DOI: 10.1016/j.vetmic.2009.10.006

[3]Hosamani M, Scagliarini A, Bhanuprakash V, et al. Orf: an update on current research and future perspectives[J]. Expert Rev Anti Infect Ther, 2009, 7(7): 879-893. DOI: 10.1586/eri.09.64

[4]Lederman ER, Green GM, DeGroot HE, et al. Progressive ORF virus infection in a patient with lymphoma: successful treatment using imiquimod[J]. Clin Infect Dis, 2007, 44(11): e100-103. DOI: 10.1086/517509

[5]Delhon G, Tulman ER, Afonso CL, et al. Genomes of the parapoxviruses ORF virus and bovine papular stomatitis virus[J]. J Virol, 2004, 78(1): 168-177. DOI: 10.1128/JVI.78.1.168-177.2004

[6]Haig DM. Orf virus infection and host immunity[J]. Curr Opin Infect Dis, 2006, 19(2): 127-131. DOI: 10.1097/01.qco.0000216622.75326.ef

[7]McInnes CJ, Deane D, Haig D, et al. Glycosylation, disulfide bond formation, and the presence of a WSXWS-like motif in the orf virus GIF protein are critical for maintaining the integrity of binding to ovine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin-2[J]. J Virol, 2005, 79(17): 11205-11213. DOI: 10.1128/JVI.79.17.11205-11213.2005

[8]Wise LM, Inder MK, Real NC, et al. The vascular endothelial growth factor (VEGF)-E encoded by orf virus regulates keratinocyte proliferation and migration and promotes epidermal regeneration[J]. Cell Microbiol, 2012, 14(9): 1376-1390. DOI: 10.1111/j.1462-5822.2012.01802.x

[9]Lacek K, Bauer B, Bienkowska-Szewczyk K, et al. Orf virus (ORFV) ANK-1 protein mitochondrial localization is mediated by ankyrin repeat motifs[J]. Virus Genes, 2014, 49(1): 68-79. DOI: 10.1007/s11262-014-1069-5

[10]Rziha HJ, Bauer B, Adam KH, et al. Relatedness and heterogeneity at the near-terminal end of the genome of a parapoxvirus bovis 1 strain (B177) compared with parapoxvirus ovis (Orf virus)[J]. J Gen Virol, 2003, 84(Pt 5): 1111-1116. DOI: 10.1099/vir.0.18850-0

[11]McInnes CJ, Wood AR, Nettleton PE, et al. Genomic comparison of an avirulent strain of Orf virus with that of a virulent wild type isolate reveals that the Orf virus G2L gene is non-essential for replication[J]. Virus Genes, 2001, 22(2): 141-150. DOI: 10.1023/A:1008117127729

[12]Haig DM, McInnes CJ. Immunity and counter-immunity during infection with the parapoxvirus orf virus[J]. Virus Res, 2002, 88(1/2): 3-16. DOI: 10.1016/S0168-1702(02)00117-X

[13]Li H, Zhu X, Zheng Y, et al. Phylogenetic analysis of two Chinese orf virus isolates based on sequences of B2L and VIR genes[J]. Arch Virol, 2013, 158(7): 1477-1485. DOI: 10.1007/s00705-013-1641-7

[14]Oem JK, Roh IS, Lee KH, et al. Phylogenetic analysis and characterization of Korean orf virus from dairy goats: case report[J]. Virol J, 2009, 6(167). DOI: 10.1186/1743-422X-6--167

[15]Firoj Mahmud AKM,Zillur Rahman KM, Kanti Dey S, et al. Genome Annotation and Comparative Genomics of ORF Virus[J]. Ai M, 2014, 4(15), 1117-1131. DOI: 10.4236/aim.2014.415122

[16]McInnes CJ, Wood AR, Mercer AA. Orf virus encodes a homolog of the vaccinia virus interferon-resistance gene E3L[J]. Virus Genes, 1998, 17(2): 107-115. DOI: 10.1023/A:1026431704679

[17]Chang HW, Uribe LH, Jacobs BL. Rescue of vaccinia virus lacking the E3L gene by mutants of E3L[J]. J Virol, 1995, 69(10): 6605-6608.

[18]Shors ST, Beattie E, Paoletti E, et al. Role of the vaccinia virus E3L and K3L gene products in rescue of VSV and EMCV from the effects of IFN-alpha[J]. J Interferon Cytokine Res, 1998, 18(9): 721-729. DOI: 10.1089/jir.1998.18.721

[19]Schwartz T, Rould MA, Lowenhaupt K, et al. Crystal structure of the Zalpha domain of the human editing enzyme ADAR1 bound to left-handed Z-DNA[J]. Science, 1999, 284(5421): 1841-1845. DOI: 10.1126/science.284.5421.1841

[20]Brandt TA, Jacobs BL. Both carboxy- and amino-terminal domains of the vaccinia virus interferon resistance gene, E3L, are required for pathogenesis in a mouse model[J]. J Virol, 2001, 75(2): 850-856. DOI: 10.1128/JVI.75.2.850-856.2001

[21]Vijaysri S, Talasela L, Mercer AA, et al. The Orf virus E3L homologue is able to complement deletion of the vaccinia virus E3L gene in vitro but not in vivo[J]. Virology, 2003, 314(1): 305-314. DOI: 10.1016/S0042-6822(03)00433-1

[22]Tseng YY, Lin FY, Cheng SF, et al. Functional analysis of the short isoform of orf virus protein OV20.0[J]. J Virol, 2015, 89(9): 4966-4979. DOI: 10.1128/JVI.03714-14

[23]Taghavi N, Samuel CE. Protein kinase PKR catalytic activity is required for the PKR-dependent activation of mitogen-activated protein kinases and amplification of interferon beta induction following virus infection[J]. Virology, 2012, 427(2): 208-216. DOI: 10.1016/j.virol.2012.01.029

[24]Der SD, Lau AS. Involvement of the double-stranded-RNA-dependent kinase PKR in interferon expression and interferon-mediated antiviral activity[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92(19): 8841-8845. DOI: 10.1073/pnas.92.19.8841

[25]Haig DM, McInnes CJ, Thomson J, et al. The orf virus OV20.0L gene product is involved in interferon resistance and inhibits an interferon-inducible, double-stranded RNA-dependent kinase[J]. Immunology, 1998, 93(3): 335-340.

[26]Ramos A, Grunert S, Adams J, et al. RNA recognition by a Staufen double-stranded RNA-binding domain[J]. EMBO J, 2000, 19(5): 997-1009. DOI: 10.1093/emboj/19.5.997

[27]Nanduri S, Carpick BW, Yang Y, et al. Structure of the double-stranded RNA-binding domain of the protein kinase PKR reveals the molecular basis of its dsRNA-mediated activation[J]. EMBO J, 1998, 17(18): 5458-5465. DOI: 10.1093/emboj/17.18.5458

[28]Taylor SS, Haste NM, Ghosh G. PKR and eIF2alpha: integration of kinase dimerization, activation, and substrate docking[J]. Cell, 2005, 122(6): 823-825. DOI: 10.1016/j.cell.2005.09.007

[29]Zhang P, Samuel CE. Protein kinase PKR plays a stimulus- and virus-dependent role in apoptotic death and virus multiplication in human cells[J]. J Virol, 2007, 81(15): 8192-8200. DOI: 10.1128/JVI.00426-07

[30]Haig D, McInnes C, Thomson J, et al. The orf virus OV20.0L gene product is involved in interferon resistance and inhibits an interferon-inducible, double-stranded RNA-dependent kinase[J]. Immunology, 1998, 93(3): 335-340.

[31]Sato H, Jing C, Isshiki M, et al. Immunogenicity and safety of the vaccinia virus LC16m8Delta vector expressing SIV Gag under a strong or moderate promoter in a recombinant BCG prime-recombinant vaccinia virus boost protocol[J]. Vaccine, 2013, 31(35): 3549-3557. DOI: 10.1016/j.vaccine.2013.05.071

[32]Scholl SM, Balloul JM, Le Goc G, et al. Recombinant vaccinia virus encoding human MUC1 and IL2 as immunotherapy in patients with breast cancer[J]. J Immunother, 2000, 23(5): 570-580. DOI: 10.1097/00002371-200009000-00007

[33]Kimberlin CR, Bornholdt ZA, Li S, et al. Ebolavirus VP35 uses a bimodal strategy to bind dsRNA for innate immune suppression[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107(1): 314-319. DOI: 10.1073/pnas.0910547107

[34]Hatada E, Fukuda R. Binding of influenza A virus NS1 protein to dsRNA in vitro[J]. J Gen Virol, 1992,73:3325-3329.

Progress on virus interferon resistance gene encoded by Orf virus

WANG Ling-ling,LIU Yong-jie,ZHENG Hai-xue,ZHANG Ke-shan,LIU Xiang-tao

(LanzhouVeterinaryResearchInstituteofChineseAcademyofAgricultureScience,StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology,NationalFoot-and-MouthDiseaseReferenceLaboratory,Lanzhou730046,China)

Orf virus (ORFV) is one of the prototype species of theParapoxvirusgenus of thePoxviridaefamily and causes serious zoonotic infectious disease. The genome of ORFV ranges in size from 134 kb to 139 kb, containing about 130 genes. VIR encoded by ORFV is a protein involved in interferon resistance and plays an important role in the progress of ORFV breakthrough host immune barrier. This paper reviewed the status and research progress of VIR.

orf virus; VIR gene; research progress

s: Zhang Ke-shan, Email: zks009@126.com,Liu Xiang-tao, Email: hnxiangtao@hotmail.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.019

国家自然科学基金(No.NSFC-31201914)，中国博士后科学基金(No.2013M530683)和 国家现代肉羊产业技术体系(No.CARS-39)联合资助

张克山,Email：zks009@126.com; 刘湘涛,Email: hnxiangtao@hotmail.com

中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室，国家口蹄疫参考实验室，兰州 730046

S852.65

A

1002-2694(2015)12-1181-04

2015-04-01；

2015-07-27

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31201914), the China Post Doctoral Science Foundation(No. 2013M530683), and the China Agriculture Research System(No. CARS-39)