绵羊精液冷冻技术及其发展概况

王俊峰

(贵州凯里黔东南民族职业技术学院,贵州黔东南 556000)

绵羊精液冷冻技术及其发展概况

王俊峰

(贵州凯里黔东南民族职业技术学院,贵州黔东南 556000)

家畜精液保存技术是20世纪随着人工授精技术广泛应用而产生的。原理是通过降低或一致精子新陈代谢强度达到延长精子在体外寿命的目的。由于较高的使用性和可观的经济效益，在近几十年得到长足发展。现已研究的稀释液包括柠檬酸盐——糖类、奶类、蔗糖类、棉籽糖类、三基类和其他含保护剂的抗氧化的溶液。冻精子宫颈输精的产羔率与冷冻技术和输精操作有关。本文重点介绍绵羊冷冻精液的保存、人工输精技术。

1 绵羊的精液冷冻历史

绵羊精液冷冻保存技术研究开始于20世纪50年代。Emmens（1950）将绵羊精液冷冻到-79℃获得了较高的存活率。后来，Mkorozzov（1964）[1]和PLKATILOVA（1960）分别用含30%卵黄、16%甘油的高渗卵黄-柠檬酸盐-葡萄糖-甘油稀释液和等渗的卵黄-柠檬酸盐-阿拉伯糖稀释液都获得了较高的产羔率。

2 绵羊精液冷冻保存的稀释液

为了延长精子在体外的存活时间和授精力，便于保存和运输，常向精液中加入适宜精子存活的稀释液。对稀释液的基本要求包括：pH、缓冲性、渗透压和低温保护性能。常规的稀释液可分为6种：

2.1 柠檬酸盐-糖类稀释液

Emmens等（1950）试验发现，柠檬酸盐液加0.9%～1.25%，阿拉伯糖的冻精存活率高。大多研究者发现提高稀释液渗透压可增加冻精存活率。如，Kuznecov等（1959）用高渗的柠檬酸盐-葡萄糖-卵黄液获得产羔率提高。

2.2 奶类稀释液

奶类用于精液冷冻时要加入阿拉伯糖、果糖或卵黄（Blackshaw，1955；……Aumdal 等，1982）。

2.3 乳糖类稀释液

Marinov等（1983a，1984）证实，乳糖-卵黄液加12%EPC-20或EPC-6（多不饱和脂肪酸与乙二醇的复合物）对精子超微结构保护性较好。Zheltobrjuk等（1981）报道，乳糖-卵黄液中添家5%～6%polyglukine或10%repolyglukine（一种高分子葡萄糖浆合物），冻精存活率和授精率提高。Fiser等（1987～1990）试验在乳糖-葡萄糖稀释液中冷冻绵羊精液获得了可接受的授精率。

2.4 加抗氧化剂的蔗糖类稀释液

蔗糖作合成稀释液主要成分是因为蔗糖对精子顶体保护性能优于葡萄糖、果糖或乳糖。又由于绵羊精液不像其他畜种其中不含抗氧化剂。因此，通常在蔗糖类稀释液中添加合成的抗氧化剂，以抑制精子磷脂成分特别是不饱和[廿二碳（22∶6）和廿碳（20∶4）]脂肪酸的过氧化反应。研究证实，维生素E添加到含葡萄糖ETA-Na2或三基的糖类稀释液中，对精液进行无氧冻前处理效果好（Varnavshkij等，1976；M·lovanov等1976）。Nauk等（1992）报道，乳糖-卵黄稀释液添加抗氧化剂Fenozane和epihyd能提高解冻后镜子活力。后一种还能提高授精率。

2.5 棉籽糖类稀释液

Varnaskij等（1974）试验结果表明，在棉籽糖-柠檬酸盐-卵黄和棉籽糖-乳糖-卵黄液中冷冻的绵羊精液的产羔率略高于乳糖-卵黄液。

2.6 三基类稀释液

三基[teis（hydroxymethyl）aminomethane]（三羟甲基氨基甲烷）高浓度对精子毒性低，具有良好的缓冲性、利尿性和渗透性。Salamon等（1972）酒浆三基-葡萄糖稀释液应用于试验中，并于1976年推荐作为绵羊精液冷冻稀释液。

2.7 其他稀释液

Good等（1996）提出的两性离子缓冲剂如N-三基（羟甲基）甲基-2-氨基磺酸（tes）、N-2（羟乙基）哌嗪-n-2-乙烷磺酸和哌嗪-N、N-bis（2-乙烷磺酸）（pipes）的缓冲性能优于三基。哈福，赵有璋等（2003）证实，将山梨醇、氯前列烯醇、复合维生素B在绵羊冷冻精液稀释液中进行添加、筛选。解冻后活率结果显示，1号稀释液（41.17±4.72）%和4号稀释液（37.76±3.15）%极显著地高于对照组稀释液（22.80±4.49）%（P〈0.01）。表明，在绵羊冻精稀释液中添加复合维生素B可有效提高冻精解冻后活率并保护精子形态结构的完整性（2）。

3 绵羊精液冷冻保护剂

已证实多种制剂和物质可作哺乳动物精子的低温保护剂，其中甘油和卵黄是最常用的绵羊冷冻保护剂。

3.1 甘油

甘油的保护作用与甘油能浓缩或结合细胞内水有关。另外还有稀释作用，可降低溶液中盐的解离度和冷冻液的渗透压。另据Milovanov（1962）研究甘油还有阻碍冰晶核形成和增长的性能及灭菌作用（3）。因此是较好的低温保护剂。

3.2 卵黄

卵黄有维持精子活力、保护精子顶体和线粒体膜的作用。它还是一种“渗透性缓冲剂”，使精子能耐受低渗和高渗，且其浓度范围较大。

3.3 其他

由于甘油最大的缺点是，它对精子的活力和授精力的毒害作用，这就激发人们对顶体保护作用的其他试剂和抗冻剂的研究。如侯荩褒用乙酰胺在小尾寒羊的精液冷冻试验中，解冻后精子活力最高为45%，几次平均值为26%（4）。

3.4 稀释比例

Platko（1965）的对比试验结果证明，4倍和8倍稀释的冻精存活率提高2倍和16倍。现在人们常用的最终稀释比例（精液于稀释液之比）：颗粒精液为1∶1，安瓿精液和细管精液为1∶3（颗粒精液及安瓿精液采用两次稀释法，细管精液采用一次稀释法）。

4 绵羊冷冻精液平衡

精液稀释后的平衡是最早由Polge 等[5]在研究公牛精液冷冻方法时提出的。平衡的温度一般为4℃～5℃，精液经过平衡处理后能够改进冷冻效果。精液稀释后逐渐降温到4℃的过程是精子代谢减少的适应过程。过慢或过快的冷却速率会导致精细胞膜脂蛋白复合体被破坏和膜被分解。当细胞膜脱水收缩达到临界最小体积时，又会使细胞膜的渗透性产生不可逆的损伤，原来不能透过膜的溶质变成可渗透性的，进而造成细胞损伤或死亡（Mazur[6]）。有资料报道山羊精液在冷冻前的平均损伤率为19.4 %，冷冻后的平均损伤率为17.1 %。因此，平衡方法对冷冻精液的品质有重要影响。

4.1 平衡方法

（1）在30℃的环境下，分装稀释精液于细管内，并用聚氯乙烯醇粉末封口，随后在5℃的环境中平衡1.5 h；（2）在30候℃环境下把稀释精液放入管内，与细管一起在5 ℃的环境中平衡1.5 h，而后在5℃环境中分装（7）

4.2 平衡时间

早期的研究者应用两步法冷冻精液时对最适平衡时间持不同观点。Lopatko[8]在精液冷冻实验中使用12～16 h的平衡时间，而Fiser et al.[9]倾向于较短的平衡时间。Lapatko[10]在考察了0～20 h范围的平衡时间之后认为，最佳平衡时间为4 h。Jones et al.[11]报道平衡时间与稀释比例有关。Salamon[12]通过实验发现应用二次稀释法冷冻颗粒精液的最佳平衡时间是2.5 h。Lightfoot[13]的研究证实，颗粒冷冻精液的平衡时间与糖的类型及甘油的浓度有关。Bauer et al.[14]报道平衡2 h和6 h的产羔率分别是43%和3%。而陈亚明，赵有璋等（2002）推荐生产实践中应用200 ml体积水浴2.5 h降温到4 ℃的平衡方法（15）。

5 绵羊精液分装与冷冻

5.1 分装方法

（1）在玻璃安瓿或塑料细管上加印精液纺号及冷冻日期等标记。

（2）安瓿精液 经过二次稀释后的精液，立即在3℃～4℃下进行分装（1 ml安瓿）和火焰封口。

（3）细管精液 用5 ml注射器，在室温下分装与0.25 ml细管内，并随即用塑料株或聚乙烯醇封口。细管精液不宜过满，封口后中间应保留一定空隙，以防解冻时细管暴烈。

5.2 冷冻方法

5.2.1 颗粒精液

①干冰法：用特制扎孔器或普通玻璃棒在预先摊平，压实的干冰上戳上排列整齐的齐圆光滑的小孔（直径0.4 cm，深2～2.5 cm）再用滴管吸取稀释混匀的精液，按0.1 ml容量逐穴滴冻，经4～5 min即可拣取，存放与液氮中。

②液氮法：先将液氮注入12磅广口温瓶内，随后放置漂浮冷冻器，钢网面保持以地温温度计测试温度，随时调节漂浮冷冻器铜网与液氮面的距离（约3 cm），确保铜网面温度保持在-80℃左右，用滴管吸取精液，按每粒0.1ml滴冻。加盖停留4 min浸入液氮，用小勺收取。精液分批冷冻，第二批滴洞前，需用干纱布将铜网面擦净。

5.2.2 安瓿精液

安瓿精液由直径25 cm、深20 cm的铝筒，周围加5 cm厚保温材料并固定在特制木箱里的液氮槽和一个直径18 cm、深3～4 cm带网眼的漂浮器制成简易冷冻器，冷冻时，向液氮槽内注入约1 L液氮，将约40支安瓿精液平放入漂浮器，置于距液氮面2 cm处，停留7 min后浸入注入液氮。

5.2.3 细管精液

常用与羊的冷冻细管：0.5 ml 法国细管，0.25 ml法国细管和0.25 ml德国微细管。细管精液冷冻一般是在液氮汽中，通过调节细管与液氮面的距离来控制降温速度。细管精液降温速度变化曲线的形状是很重要的，不应呈线性。Milovanov等（1980）认为，降温曲线是符合t=T2/2p公式的抛物线，其中t代表精液温度，T是降温开始后的时间（分钟），p是抛物线参数（决定曲线坡度）。已证实对绵羊精液最适合的参数是0.01～0.15，可以通过调节细管与液氮面的距离来达到。

6 解冻

解冻同冷冻过程一样必须迅速通过精子冷冻的危险区（-15℃～-60℃），才不至于对精子造成损害，这主要取决于降温速度是否高到足以引起精细胞内液体的冻结和降低到足以引起精细胞脱水（Park等1992）。

6.1 细管冻精的解冻

近年来，绵羊细管冷冻精液的解冻温度和时间变化很大，如Maxwell.W.M.C.et al（1994）直接将细管投入37℃水中60 s，而后吹出精液与37℃水浴锅的试管中，检查火力；Ingrid Olesenz（1993）直接把0.25 ml微细管放于70℃水浴中解冻8 s；澳大利亚西沃大学畜牧科学院介绍他们牧场的解冻方法：从液氮中取出细管，在37℃的水中摇动4 s，剪开一段，把精液吹入38℃的水浴锅的容器内，10 s后吸出0.1 ml进行腹腔内窥镜输精。Johnson等（1974）发现，69.5℃解冻有利于提高存活率，而慢速解冻（45.6℃）有利于保护精子顶体。

6.2 安瓿冻精和颗粒冻精解冻

绵羊安瓿冻精解冻较好的方案是慢速解冻（室温下，15℃/ min）。也有报道说安瓿解冻可在37℃的温水中解冻，颗粒解冻可以在解冻液（湿解冻）或试管中（干解冻）。起初报道，湿解冻优于干解冻，另一些研究中，30℃～45℃间存活率没有太大差异，37℃下干解冻存活率高于45℃，60℃或75℃的湿解冻（Fukui，1979）。

7 结论

精液冷冻保存和输精技术的掌握是关系到人工授精和胚胎移植技术的发展，关系到种公羊的利用和经济效益的提高的龙头技术，只有牢固掌握稀释液种类及其成分及添加方法，冷冻保存浓度，冻前稀释，降温及解冻速度及方法和子宫深部输精技术，才能将人工授精和胚胎移植技术推向发展。但是，目前冻精授精率还不尽如人意，这就需要我们深入研究其中的原因和采用好的冷冻输精技术。

[1] 哈福，赵有璋.羊冷冻精液稀释液中添加复合维生 素B提高冻精解冻后品质的研究 甘肃农业大学学报，2002，（3）：17-19.

[2] Polge C，smith A U，Parkes，A S. Revival of spermatogoa after vitrification and dehydration at low temperature[J]. Nature，1949，（164）：666

[3] Mazur R C. The rule of intracellular freezing in the death of cells cooled at supraoptimal rates[J]. Cryobiology，1977，（14）：251.

[4] Lopatko M I. Method of freezing ram semen at temperatures of ?83 or ?96℃（in Russian）[J]. Zhivotnovodstvo. 1962，（10）：86-88.

[5] Fiser P S. Faithfull R W. The effect of rapid cooling，cold shock of ram semen，photoperiod，and egg yolk in diluents on the survival of spermatozoa before and after freezing[J]. Cryobiology，1986，（23）：518-524.