猪圆环病毒2型病毒样颗粒的研究及应用

余婉婷 湛 洋 雷昕诺 张 颜 谢小红 王乃东 邓治邦 王爱兵 杨 毅

(湖南农业大学,湖南长沙 410128)

猪圆环病毒2型病毒样颗粒的研究及应用

余婉婷 湛 洋 雷昕诺 张 颜 谢小红 王乃东 邓治邦 王爱兵 杨 毅*

(湖南农业大学,湖南长沙 410128)

自20世纪90年代中期起，猪圆环病毒2型（PCV2）引起的猪圆环病毒病在全球范围内大规模爆发，给世界各国造成了巨大的经济损失和环境灾难。2013年，英国皇家兽医学院Alarcon，P等对PCV2给英国养猪业所造成的经济损失进行了科学的统计，研究结果表明，2008年PCV2造成5.23千万英镑的损失，而在PCV2流行期所造成的直接经济损失可达8.8千万英镑[1]。我国生猪出栏量居世界第一，占据世界约50%的产量。但是，猪圆环病毒对我国养猪业的影响也相当巨大，造成每年至少数百亿人民币的直接经济损失。2013年初，上海黄浦江上出现大量的死猪，官方报道，猪圆环病毒是唯一检测出的病原体。猪圆环病毒不仅给养殖业带来重大的经济损失，而且影响我国的食品安全、环境保护和大众身心健康等。相关研究结果表明，PCV2的核衣壳蛋白质（Capsid）能在大肠杆菌中高效表达，纯化的蛋白质能在体外组装成具有细胞浸染性病毒样颗粒（VLPs）。通过蛋白质纯化技术，获得与野生型病毒大小、免疫原性类似的VLPs。由于VLP在免疫原性与野生型病毒非常相似，且不携带病毒的基因组，具有非常高的生物安全性，因此，VLP作为新一代人类和动物疫苗具有非常好的开发前景。

1 猪圆环病毒的基因分型

猪圆环病毒是单链、环状DNA病毒，分类学上属圆环病毒科，圆环病毒属。猪圆环病毒主要包括两个基因型：猪圆环病毒1型（PCV1）和猪圆环病毒2型（PCV2）[2，3]。PCV1最早在20世纪70年代被发现作为非致病性的细胞污染物在猪肾上皮细胞（PK15）中存在[4]。PCV2则被认为是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PWMS）及圆环病毒相关疾病（PCVAD）的主要病原体[2]，其基因组含有大约1 766～1 768 个碱基，编码两个主要的蛋白质（Cap和Rep/Rep’）。病毒颗粒平均大小在12～23 nm左右[2]，是目前世界发现的最小动物病毒之一。PCV2分为3个主要基因亚型：PCV2a，PCV2b和PCV2c。PCV2a和 PCV2b是目前世界主要流行的毒株，而PCV2c仅在丹麦报道过。根据病毒基因组的差异，而PCV2a又可分为：PCV2A、PCV2B、PCV2C、PCV2D、PCV2E，PCV2b又可分为：PCV、PCV、PCV[3]。

1A1B1C

2 PCV2免疫抑制作用的研究进展

分子免疫学研究表明PCV2通过感染猪的免疫细胞[5]（主要是树突状免疫细胞，DC），对浆细胞样树突状细胞（pDCs），又称天然干扰素产生细胞（NIPCs）产生免疫调控作用，导致NIPCs细胞受到其他病原体入侵或者CpG寡核苷酸（CpG-ODN）等因子的刺激或诱导后，产生的干扰素-α和肿瘤坏死因子-α的功能丧失，产生免疫沉默，机体的天然免疫功能丧失[6]。进一步的研究表明，PCV2DNA是导致 NIPCs免疫沉默的直接原因[7]，并损害pDCs和单核细胞来源的树突细胞（DC）肌动蛋白的聚合功能及这些细胞的内吞作用[8]。猪圆环病毒病在临床上常表现为PCV2与其他病原体的混合型感染[9，10]（如，猪蓝耳病病毒、猪细小病毒和猪肺炎支原体等）。因此，一种可能性的病理机制为：由其他病原体所引起的感染，导致非特异性地免疫激发，并且有可能通过改变细胞免疫（如，细胞因子的产生和种类）造成PCV2在猪免疫细胞中大量的复制和积累；同时，PCV2的大量扩增进一步产生免疫抑制，导致猪对其他病原体产生更强的易感性[9，11]。由于PCV2和其他病原体之间的相互促进作用会对猪产生很强的致病力，因而PMWS综合征导致猪死亡率非常高，可达到90%以上[12]。大量的基础研究和临床实验数据使很多研究者产生共识：PCV2所导致的PWMS是一种获得性免疫缺陷症[10，13，14]。

目前，正在评估猪圆环病毒对人体细胞的浸染性及其危害。由于人体疫苗生产过程中大量使用到动物血清和胰蛋白酶，最近，在人轮状病毒（rotavirus）和脊髓灰质炎病毒（poliovirus）的疫苗及生产这些疫苗所使用的细胞中检测出到PCV1和PCV2DNA[15，16]，体外细胞培养实验证明，PCV在细胞中具有浸染和扩增的特性，并不断产生适应期宿主细胞的基因突变[15]。Beach，NM 等研究证明PCV1能浸染人肝脏肿瘤细胞，并且能有效扩增[17]；体外细胞实验证明PCV1能浸染人T淋巴细胞，引起细胞发生病变[18]。

3 PCV2入侵细胞机制的研究近况

PCV2入侵宿主细胞主要有两个关键步骤：（1）吸附；（2）入侵。首先，PCV2与宿主细胞膜表面受体相互作用。到目前为止，并没有PCV2的特异性受体的报道。很多病毒利用黏多醣（GAG）作为细胞膜上的广谱性受体，Misinzo G.等报道PCV2VLPs可通过与细胞表面硫酸乙酰肝素（HS）或者硫酸软骨素B（CS-B）结合而浸染细胞[19]。减少以上受体分子在细胞膜上的分布，将会明显抑制PCV2VLPs的浸染。PCV2的细胞内化过程的分子机理目前还不是十分清楚，有研究认为，PCV2在不同的细胞系中，使用不同的浸染途径。例如，在猪的3D4/31 单核细胞系中，PCV2是通过Clathrin介导的内吞作用进入细胞，产生浸染[20]。然而，在猪肾上皮细胞（PK15 cells）中，PCV2也可以通过Clathrin介导的内吞作用进入细胞，但此途径并不能导致病毒在细胞中有效复制，相反抑制Clathrin介导的内吞作用，可以大幅度提高PCV2浸染PK15细胞的能力[21]。很明显，在PK15细胞系中存在着一种我们未知的PCV2浸染机制，但以上各种浸染过程都依赖于丝状肌动蛋白，在培养基中加入actin聚合抑制剂，会导致PCV2失去浸染能力[20，21]。PCV2浸染树突状细胞后，并不会立即启动复制，但其对细胞依旧能保持感染力，由此可以推测PCV2可能是利用一种未知的免疫入侵机制，逃逸免疫细胞降解的途径来感染其他细胞，与此同时，PCV2病毒借助于树突状细胞自身的迁移能力，将其作为自身传播的载体，在不进行自我复制的情况下完成持续感染[22]。

尽管近些年已经对PCV2浸染机理做了初步的研究，但是，PCV2的内吞途径、与细胞骨架及宿主细胞的相互作用以及产生免疫的分子机理仍然不清楚，而这些对我们从根本上理解PCV2的致病机理及疫苗的研究与应用等都起着十分重要的作用。普通的细胞培养很难产生高滴度的PCV2，因此，研究都使用到较高浓度的PCV2VLPs代替PCV2来研究其浸染机理[19～21]。

4 PCV2 VLPs 国内外研究与开发的现状

借助于昆虫-杆状病毒表达系统已经成功地表达PCV2的核衣壳蛋白质[23，24]，通过密度梯度离心后可以获得高纯度的PCV2VLPs。在此基础上开发的PCV2VLPs亚单位疫苗，已经成为目前国际市场的主要疫苗种类。其免疫保护效果非常好，自使用后，PCV2的流行在欧美等地得到迅速控制，产生很好的社会及经济效益。但是，利用昆虫-杆状病毒表达系统生产PCV2VLPs疫苗生产工艺复杂、价格高，限制了其大规模使用。目前我国还不具备生产能力，并且由于价格原因（在我国，调查显示PCV2疫苗的价格是决定养猪业主是否使用疫苗的首选因素[25]），进口疫苗的使用率非常低。如果利用其他表达系统（如：原核表达系统等产生PCV2VLPs）将大幅度降低PCV2VLPs的生产成本。很多研究者利用大肠杆菌表达PCV2的Capsid蛋白质，并在体外组装成，但多数是以失败告终[26]，2013年，Yin等将Sumo-标签融合到PCV2Capsid基因5 ’端，能提高Capsid蛋白质在大肠杆菌中表达及可溶性，纯化后的融合蛋白质，通过酶切去掉Sumo-标签后，PCV2Capsid蛋白质能在体外成功地组装成PCV2VLPs[27]。

5 VLPs研究和开发的意义

VLPs 的研究和开发具有十分重要的生物学意义，是目前生物医学研究的热点和重点。VLPs具有以下基础及应用价值：（1）VLPs保留有野生型病毒颗粒的免疫原性，但不含有病毒基因组成分。因此，具有很好的免疫原性和生物安全性；（2）VLPs能有效地刺激机体产生天然免疫（类似于佐剂）。由于VLPs的颗粒大小一般在20～100 nm，较普通蛋白质抗原要大得多，所以它们也能更好地刺激机体产生非特异性免疫；（3）基于VLPs的二价和多价疫苗。由于VLPs是多亚基蛋白质复合物，可以通过基因工程的方法，将其他病原体的中和抗体表位插入到某个病毒VLPs的非关键区，从而产生多价疫苗；（4）可以作为新一代人类和动物药物载体：药物分子如何跨过细胞膜的屏障作用有效地进入细胞，一直以来是生物医学研究的难点和重点问题。VLPs具有与野生型病毒类似的细胞浸染能力，所以，它们能够有效地携带药物分子、siRNA甚至DNA分子进入细胞。如，人类子宫颈乳头瘤状病毒的VLPs能有效携带干扰性RNA分子进入到靶细胞，从而起到有效地治疗作用[28]。

6 VLPs的研究和应用存在的挑战

VLPs作为疫苗，与传统疫苗比较，相关的设计、表达、组装及纯化等对技术条件要求比较高，而且不是所有病毒都能组装成VLPs。同时，以VLPs为基础的二价或多价疫苗，需要对VLP载体本身的蛋白质结构和功能进行大量的基础研究。例如，以蛋白质三维结构为基础的，将另外一个或多个病原体的中和抗体表位插入到VLP中s，需要保证其插入点不影响VLPs的表达和组装，且不影响两者的免疫原性和细胞浸染性等。

目前，许多病毒VLPs的表达都是以哺乳动物细胞或者昆虫细胞为表达系统，造成生产成本过高，限制了其大规模应用。还需要解析VLPs的体外组装、去组装的分子机理等来实现VLPs作为药物载体可能性。

7 PCV2VLPs的研究和应用的优势

很多病毒VLPs 的表达和组装需要共表达两个或者两个以上不同的病毒衣壳蛋白质（VP1，VP2等），这样为VLPs 设计和制备提高了难度。而PCV2VLPs仅由一种核衣壳蛋白质构成，仅需要表达一种蛋白质就能有效地产生VLPs。PCV2Capsid 蛋白质的三维晶体结构已于2011年被解析出来[29]，为以PCV2VLPs作为载体的二价及多价动物疫苗提供了基础。

研究发现，PCV2以硫酸乙酰肝素（HS）作为广谱性受体，但目前没有发现PCV2的特异性细胞受体[30]。从其细胞入侵动力学过程来看，很多学者认为PCV2的浸染并不需要特异性受体，因此，它对大多数哺乳动物细胞都具有浸染性。因而，对PCV2VLPs改造后，可以作为动物及人体药物携带的有效载体。

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余婉婷，女，1990年出生，湖南常德人，湖南农业大学动物医学预防兽医硕士生，邮箱：ywt1017806202@163.com

“国家自然科学基金项目”(31372406), “国家自然科学基金项目”(1014 2R0176)

， E-mail：yangyi.proc@gmail.com