试论HE染色质量应用的体会

王志生 郭海燕 孙 岩 武 艳*

（吉林省肿瘤医院，吉林 长春 130012）

试论HE染色质量应用的体会

王志生 郭海燕 孙 岩 武 艳*

（吉林省肿瘤医院，吉林 长春 130012）

目的 通过对常规HE染色方法的改进，提高HE染色质量，为临床病理检测提供更优质保证。方法 对常规HE染色中的试剂配制、无水化处理、封片树胶配制及分化过程等方面加以改善，观察对结肠组织的染色质量。结果 染色质量好，结肠组织整体染色鲜艳，较深，红蓝的对比清晰可见，细胞核染色呈深蓝或蓝色，染色质染色清晰，细胞质色呈粉红或鲜红色，核仁核模染色清楚可见结肠组织及外周无明显苏木精沉积。结论 通过对切片HE染色过程技术的改善，可为临床病理检测工作提供切实保障，值得临床推广使用。

HE染色；质量；应用体会；分化

临床病理检测已经伴随人们走过一个多世纪，其中HE染色技术是最常用及最可靠诊断方法，染色稳定，操作简单及色彩鲜艳是其优点，但染色效果不够稳定的现象亦时有发生，因此做好各个环节的染色工作尤其重要［1-4］，现本文就如何做好HE染色质量的工作，浅谈体会，探讨如下。

1　材料与方法

1.1材料：标本选择本院送检的结肠组织；苏木精；梯度乙醇（75%、85%、95%及无水乙醇）；甘油；伊红，冰醋酸、柠檬酸及碳酸氢钠，酸性饱和硫酸铝钾溶液，酸性乙醇。

1.2试剂配制：①苏木精配制方法：将5 g苏木精溶解于50 mL无水乙醇中，将100 g钾明矾溶解于1000 mL蒸馏水中，加热沸腾钾明矾，将溶解好的苏木精加入其中，再将115 g黄色氧化汞加入其中，共沸2 min后，冷水冷却，将1 g柠檬酸加入其中，轻轻搅拌，再加入50 mL甘油。每次可配制1000 mL，用时再过滤，用时可持续11周，染万张切片［1］。②伊红染液配制方法：参考文献［5］。③酸性乙醇溶液配制：将2 mL冰醋酸加入400 mL 95%乙醇中即可。④酸性饱和硫酸铝钾溶液配制：将10 mL冰醋酸加入400 mL蒸馏水中，再加入硫酸铝钾使其达到饱和。

1.3组织处理。取材：结肠组织；固定：在10%的中性福尔马林中固定18～24 h；脱水：用梯度乙醇脱水12 h；透明：在二甲苯中浸泡2 h；浸蜡：浸泡在65 ℃石蜡中3.5 h；包埋：用自动包埋机进行包埋；切片：切片厚度为4 μm。脱蜡：二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化［2］。

1.4染色：①苏木精染色：将玻片放在饱和硫酸铝钾中，震动3次（5 s），用配好的苏木精进行染色3 min。②伊红染色：用0.5%的伊红溶液将切片染色3 min，取出后立即用蒸馏水冲洗2 s，再快速放入85%乙醇中2 s，进行分色，取出晾干，用95%乙醇进行脱水25 s，再用无水乙醇脱水50 s，晾干后再用二甲苯进行透明。

1.5染色质量判定：染色质量好的判定: 色彩鲜艳，红蓝色分明，苏木精无沉渣聚集，核浆的对比清楚；反之则为染色质量差。

2　结 果

染色质量好，结肠组织整体染色鲜艳，较深，红蓝的对比清晰可见，细胞核染色呈深蓝或蓝色，染色质染色清晰，细胞质色呈粉红或鲜红色，结肠组织及外周无明显苏木精沉积，核仁核模染色清楚可见。

3　讨 论

HE染色技术属于病理学、组织学中最常用方法，操作简单，色彩鲜艳，但是常规的HE染色方法往往存在以下问题：切片组织的染色质量差，不鲜艳，红蓝的对比不清楚，细胞核染色呈淡蓝或灰蓝色，细胞质染色呈淡红色，核模核仁染色不明显，核质对比不清晰，组织及周围经常会有明显的苏木精沉积。因此本院就常规HE染色方法加以改善，取得良好效果，现将体会总结如下：

3.1苏木精配法改善。苏木精有两种配制方法：自然氧化法及人工氧化法。苏木精本身分子中缺少发色基团，但当经过氧化时就可成为染料，因此我们常把氧化后的苏木精称为苏木红，常用自然氧化的苏木精很难变为苏木红，因此所需时间较长，而人工氧化法可克服这一缺点，其中最常规配方为Harr's方法，此配方广泛应用原因在于：染色速度快，颜色鲜艳等，但在实际应用过程中，常常因苏木精的过度氧化而引起染色快速消失现象的发生，有效期明显缩短。因此本实验改进苏木精配置方法，如上述实验方法中提到，改善后可明显使染色寿命增长，染色质量增强。原因在于改良配方中加入了氧化剂物质，将苏木精分子的两个苯环丧失氢原子，导致结构变成醌型苯环结构，此为发色基团，其羟基为助色基团，因此适量的氧化剂可使苏木精在较短时间内就可变成苏木红，而且亦不会因过度氧化而引起苏木红破坏，在使用过程中，苏木精未氧化部位可自动氧化为苏木红，源源不断的补充被消耗掉的苏木红分子，保持染液的稳定性持久［3］。

3.2改善伊红染色。改进前染色方法：切片在晾干后，用梯度酒精进行脱水，相继浸入75%乙醇及85%乙醇及95%乙醇中脱水25 s，最后再用无水乙醇脱水30～60 s。改进后染色方法如上述实验部分所述，改进后与改进前比较，胞质染色明显变清晰均匀，而且质感很好［4］。

3.3无水化的处理：①苏木精染液：在以往HE常规染色中，切片常经脱蜡水处理，因此在进入苏木精染液中时会掺入自来水，且自来水随时间增加而不断增多，因苏木精显酸性，pH值小于自来水，因此染液的pH值不断增高，OH-离子会逐渐增多，OH-离子与Al3+反应，使游离的Al3+变少，迫使铝合苏木红数量降低，DNA侧链磷酸基团结合苏木红变少，导致细胞核染色变淡，且如果染液pH值大于胞质等电点时，细胞质中的氨基酸等物质会酸化带负电荷，这时铝合苏木红可与其非特异性地结合，细胞质染色，造成背景颜色过重。除此之外，染液pH值增高使苏木精氧化过快，且铝合苏木红分子中带负电荷的羟基可使其自身相互结合，导致苏木精聚集导致沉渣生成。苏木精的高pH值使细胞核与苏木精的结合能力降低，与核外亲和力增强，出现染色时间过长，玻片及细胞质亦染色，且核质染色分界线模糊，呈灰色或黑色。无水处理：将切片用酸性饱和硫酸铝钾溶液处理片刻，将切片中得水分去除，再将结肠组织切片浸入苏木精染液。优点：在环境相似情况下，染液可迅速进入细胞核进行染色； 酸性饱和硫酸铝钾溶液与苏木精染液pH值相似，不会影响苏木精的染色质量，且不断补充因染色损失的酸性铝离子。②伊红染液：pH值对伊红染液影响较大，因自来水的增多，pH值不断升高，当染液pH值高于胞质等电点时，胞质因酸式电离导致负电荷产生，同是酸性染料的伊红与带负电的胞质同性相斥，导致伊红与细胞质结合能力下降，细胞质不能染色或染色较浅，切片的整体效果模糊不清，蓝红不分明，染色质量差。因此，本院在切片脱水后先行污水处理再浸入苏木精染液。无水处理：将切片用酸性乙醇溶液处理片刻，将切片中得水分去除，再将结肠组织切片浸入伊红染液中染色。保证伊红高效快速的染色，其染色质量好且稳定［5］。

3.4封片树胶配制改善：封片前可将少量无水碳酸加入到树胶瓶中，不断搅拌后放入低温干燥箱数日，让其自然澄清，留取上清液备用，这样的封片树胶可防止使用时的黏性过大导致染色质量差，封固持久耐用。

3.5分化过程注意事项：分化目的在于细胞核染色适中及胞质中没有背景色产生。在分化过程中首先核周围物质脱色，其次为细胞核脱色，当核脱去一部分颜色后，达到适中染色时即可停止分化；水洗返蓝，显微镜下观测，要求细胞核形态清晰可见，且不存在背景色，经伊红染色后呈现核浆蓝红色对比清晰可辨，方便病理检测。在分化过程中，如发生分化不过状况，则细胞核颜色会呈浓蓝色，核质形态分辨不清，会发生浅蓝色背景，伊红染色后呈红紫色，染色质量差，导致观察困难。如发生分化过度状况，细胞核染色呈浅蓝色且形态模糊，病理检测困难。因此，分化始终尤为重要：①盐酸酒精浓度: 盐酸酒精浓度控制在1%之内，必要时适当降低可将盐酸酒精浓度，其分化的时间要根据盐酸酒精浓度做调整，随着盐酸酒精浓度增加，分化时间随之降低，反之则分化时间加长；②适当分化:在分化过程中要密切观察，当切片颜色由深蓝色转为粉红色时，立即停止分化，将其放入流水中。流水目的：冲掉残留的盐酸酒精，快速终止分化［6］。

上述结果表明，改善后的切片染色质量好，结肠组织整体染色鲜艳，较深，红蓝的对比清晰可见，细胞核染色呈深蓝或蓝色，染色质染色清晰，细胞质色呈粉红或鲜红色，核仁核模染色清楚可见，结肠组织及外周无明显苏木精沉积。可为临床病理检测工作提供切实保障，值得临床推广使用。

［1］ 田玉旺，李琳，朱红艳.常规HE染色易出现的问题原因及解决方法［J］.诊断病理学杂志2012，15（6），500-502.

［2］ 刘少颜.介绍一种改良的骨髓石蜡包埋组织网状纤维染色技术［J］.临床与实验病理学杂志，2013，1（1）:104.

［3］ 章栽良，顾元忻，郑晓瑾.冰醋酸在常规HE制片中的应用［J］.诊断病理学杂志，2011，16（5）:389.

［4］ 王伯沄，李玉松，张远强.病理学技术［M］.北京:人民卫生出版社，2010:96-134.

［5］ 仲剑平.医疗护理操作常规［M］.4版.北京:北京人民军医出版社，2013:1994-1995.

［6］ 唐从国.关于病理制片技术处理失当问题的探讨［J］.临床和实验医学杂志，2010，9（19）:1503.

R446.6

B

1671-8194（2015）24-0042-02