梅毒实验室检测方法的研究进展

刘 兵冯文莉*

（1 山西医科大学，山西 太原 030001；2 山西医科大学第二医院皮肤性病科，山西 太原 030001）

梅毒实验室检测方法的研究进展

刘 兵1冯文莉2*

（1 山西医科大学，山西 太原 030001；2 山西医科大学第二医院皮肤性病科，山西 太原 030001）

梅毒是一种严重危害人类健康的性传播疾病，临床上主要借助实验室检测对其进行诊断。近年来，快速、灵敏和特异性高的检测方法在不断更新完善中。本文主要从病原学、血清学、分子生物学、脑脊液四方面对梅毒实验室诊断的最新进展作一综述。

梅毒；病原体；血清学；分子生物学；脑脊液

梅毒（syphilis）是由苍白密螺旋体的苍白亚种即梅毒螺旋体（Treponema pallidum，TP）所引起的一种慢性、接触性传染病，近年来其发病率有明显上升趋势[1]。TP由Fritz Schaudinn和Erich Hoffmann于1905年首次发现，为纤细的密螺旋体，运动活泼，可以旋转、蛇行、伸缩三种方式运动，感染机体后可产生两类抗体：一类为非特异性抗体，该类抗体能与广泛分布于生物组织中的类脂抗原发生非特异性反应；另一类为特异性抗体。针对TP生物学及免疫学特性，梅毒实验室诊断技术主要是从病原体、血清学、分子生物学、脑脊液四方面开展。

1 病原体直接检测

1.1 暗视野显微镜检查TP（DF）：暗视野显微镜可直接观察到病灶分泌物中运动活跃的苍白螺旋体，结合临床症状可直接诊断梅毒。该法操作简单，且经济、快速，但敏感性较低，检测阳性率为65%～70%，主要受病程、某些外加因素以及检测人员技术水平影响，而且对部分二期梅毒皮疹、隐性梅毒或口腔病灶标本不适用。

1.2 镀银染色方法检查TP（Wartbin starry）：由于TP具有亲银性，可将TP染成棕褐色或黑褐色，且层次清楚，反差明显，形态清晰，背景为黄色，TP易被着色辨认，封片后可以永久保存标本。缺点是镀银染色液需新鲜配制，且不能观察TP的运动方式，易与类似TP的其他物质混淆，故临床应用很少，多用于科研和教学。

1.3 免疫荧光抗体染色：该法将TP用异硫氰酸荧光素标记的抗TP抗体或单克隆抗体染色，利用抗原抗体特异性反应，荧光显微镜观察抗原抗体复合物出现绿色荧光，表明检测标本中含有TP，但需要荧光显微镜设备，技术条件要求较高。

2 梅毒血清学检测

梅毒血清学检测根据所用抗原不同可分为非特异性抗体检测和特异性抗体检测两大类[2]。

2.1 非特异性抗体检测

2.1.1 康瓦试验：是最早检测梅毒患者体内抗体的方法，这种试验的抗原采自牛心肌粉酒精浸液。此试验操作复杂，易出现假阳性，目前这种试验已被临床淘汰。

2.1.2 性病研究实验室试验（VDRL）：该法属于微量玻片法，以心磷脂为抗原，加入胆固醇增强灵敏性和加入卵磷脂以提高抗原性，定性及定量检测血清中的抗类脂质抗原的非特异性抗体。该实验操作简单、快速，2 h内出结果。但是技术要求高，抗原悬液不稳定，要求待测血清新鲜而且需要加热灭活，结果需要借助显微镜观察。

2.1.3 不加热血清反应素玻片试验（USR）：本法是VDRL检测技术改良后的方法，改良措施是在抗原悬液中加入了二胺四乙酸二钠灭活补体从而使悬液更加稳定可保存4个月，又在悬液中加入了氯化胆碱可对待测血清直接化学灭活从而减少了加热灭活步骤，从而在检测时更加快速、方便。缺点是需要借助显微镜，主观性强，易出现漏检。

2.1.4 快速血浆反应素环状卡片试验（RPR）：利用从牛心中提取出来的有效成分—心磷脂、卵磷脂及胆固醇组成抗原，然后用特制的活性炭颗粒进行吸附，通过肉眼观察白色纸板上有无黑色凝集颗粒出现而直接进行结果判断。该方法操作简便、迅速，适用于大批量标本检测。缺点是当抗体含量过高时，易出现假阴性反应，即前带现象（promne phenomenon），会有漏检；还易出现生物学假阳性反应，但是RPR试验可检测抗体滴度变化，RPR滴度变化是观察治疗效果、复发或再感染的重要指标。

2.1.5 甲苯胺红不加热血清反应素试验（TRUST）：该法用类脂质（从牛心提取的心磷脂和从鸡蛋黄提取的卵磷脂及胆固醇）为抗原来检测血清中的抗类脂质抗体，原理与RPR试验类似，只是以甲苯胺红染料颗粒代替活性炭颗粒做吸附剂。试验结果清晰易读，简便快速，稳定性好，但对一期梅毒、三期梅毒及隐性梅毒进行检测时会出现假阴性反应，尤其是三期梅毒。

2.2 特异性抗体检测

2.2.1 荧光密螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）：试验以非致病性密螺旋体Reiter株作为抗原来吸收待测血清，排除了同属抗原交叉结合的可能性，特异性好。而且该法因采用了整条螺旋体进行检测，敏感性高。文献报道FTA-ABS对各期梅毒检测的特异性达到92%，对一期梅毒的敏感性为80%，二期为99%～100%，三期为95%～100%[3]；缺点是使用了活菌，存在一定的潜在危险性。而且需要使用荧光显微镜，对设备和操作要求较高，所以该法的使用受到了限制。

2.2.2 TP血球凝集试验（TPHA）：用羊或火鸡红细胞做抗原载体，吸附从兔睾丸中提取的粗制TP粉碎物抗原，检测血清中TP特异性抗体。由于试剂制备过程排除了各种非特异性反应，敏感性和特异性均较高。但试剂成本较高，操作较麻烦，且易发生自凝现象和生物学假阳性[4]。

2.2.3 TP明胶凝集试验（TPPA）：主要是把致病性TP的精致菌株成分包被在人工载体明胶粒子上检测血清中相应的抗体，该试验是TPHA的改良方法。姜泽升[5]对98例梅毒患者给予TPPA检测后，其合计阳性率为100%，结果表明TPPA具有敏感性高、特异性高等特点，是目前国内公认的梅毒确证方法，梅毒确诊的“金标准”[6]。但因其操作复杂，反应时间长，不易保存且出具滴度结果时成本较高，故临床上TPPA常用于对筛检为阳性标本进行确诊。

2.2.4 TP酶联免疫吸附试验（TP-ELLISA）：该法采用基因工程体外表达得到的TP特异抗原（常用TpN47 TpN15 TpN17）包被微孔滴定板，同时检测血清中的抗TP-IgM和抗TP-IgG抗体，利用酶的放大效应，提高检测的灵敏度，因采用了纯化的基因重组抗原，提高了其检测的特异性。在低危人群中筛查的灵敏度可达到93.8%～99%，并可实现自动化[7]。Sun[8]报道TP嵌合基因重组抗原（TpN15-47-17）及单一抗原TpN47 TpN15 TpN17分别构建双抗原夹心ELISA，平行检测965份梅毒阳性血清，结果证实前者比后者敏感度提高。由于此法操作简便，不受样本纤维蛋白和溶血等影响，一次可完成多份标本的检测，试验结果由仪器分析，客观而准确，特别适用于大批血源标本的筛检。

2.2.5 TP胶体金试验（CGT）：运用双抗原夹心法的原理，以胶体金作为标志物，用特异性TP抗原作为包被和标记抗原，在硝酸纤维素膜上进行反应来检测待测血清中的TP特异性抗体。Nessa[9]用此法检测684份女性性工作者，与TPPA方法相比较，灵敏度为94.45%，特异性为92.6%，认为这是一种非侵袭性的梅毒快速筛查方法。Lin[10]等采用优化了的具有梅毒特异性的重组蛋白TPN17和TPN47作为标记抗原，建立检测血清中梅毒抗体IgM的TP金标法，经过多年的验证，其敏感性、特异性分别为98.21%和99.04%。

2.2.6 蛋白印迹试验（WB）：该试验是通过电泳转移硝酸纤维膜抗原条上含有TP的各种成分来确认是否梅毒感染。近年来多采用具有高度免疫原性重组多肽抗原进行检测，有更好的敏感性和特异性。Welch[11]报道WB法用于梅毒确认试验优于TPPA，对二期梅毒、早期梅毒、神经梅毒阳性率为100%。对于生物学假阳性标本、r球蛋白增高和自身抗体的标本检测没有假阳性和可疑反应。

2.2.7 化学发光免疫测定（CLIA）。该法的原理为：标本或包被有重组TP抗原的微粒子与稀释液混合后，标本中的抗TP抗体同微粒子上包被的TP抗原结合，清洗后，加入标记吖啶脂（acridinium）的抗人IgM或IgG抗体，在进行另一步洗涤程序后，加入预激发液和激发液，通过测定反应液的相对光强度来检测血清TP特异性抗体水平。该法从检测到结果判定均由仪器自动完成，操作方便，人为干扰少，结果客观准确。Antonella[12]等用RPR、CLIA、TPHA、WB、ELISA五种方法对131份梅毒血清进行水平检测，CLIA法的敏感性最高，为99.2%，由此可见该法在梅毒特异性抗体检测中具有一定的优势。

2.3 基因诊断技术检测：近年来，聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术已得到广泛应用。PCR是一种体外扩增DNA技术。当存在模板DNA、底物、上下游引物和耐热DNA聚合酶时，经过多次变性、复性、延伸反应的循环过程，模板DNA就可得到大量扩增。进行PCR检测，选择特异性高的靶基因是DNA扩增首先考虑的问题。目前已有几套扩增梅毒螺旋体DNA的基因如47ku、39ku（bmp）、TPF1 tmpA、tmpB、PolA编码基因[13]。但是除梅毒螺旋体DNA多聚酶Ⅰ基因（TP-PorA）特异性较高外，大部分与其他微生物具有一定的同源性，特异性还不理想[14-15]。梅毒PCR检测方法有常规PCR、巢式PCR、逆转录PCR、多重PCR和实时PCR。常规PCR只需要设计一对相应的引物，扩增后需做凝胶电泳鉴定，故操作比较繁琐，同时扩增产物极易受到污染造成假阳性。巢式PCR先用一对外引物进行第一轮PCR，然后再使用第一对引物扩增的DNA序列内部的一对引物再次扩增，因其采用2对引物进行2轮扩增，因此敏感性和特异性均有所增强[16]。逆转录PCR是提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA；再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。用于逆转录PCR设计引物的靶基因是16srRNA，也需要Southern印迹杂交试验来保证其特异性，因此，操作比较繁琐，临床上不常使用。多重PCR是在同一个反应管中用多对引物同时扩增几条DNA片段，目前常用于与其他病原体同时检测[17]。实时荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用对荧光信号积累的实时检测来监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析[18]。由于PCR是直接检测TP-DNA，所以其检测的敏感胜和特异性均高于血清学检测，此外，良好的特异性使PCR技术在鉴别梅毒与其他螺旋体感染时显现了其独特的应用价值。PCR检测尤其适用于微量TP检测，如先天性梅毒、早期梅毒。这是因为人体感染TP后要到4～10周才产生一定水平的抗体，特异性抗体比非特异性抗体早约1周出现；缺点是PCR检测的假阳性较高，检测敏感性会受标本来源和所处病期的限制。此外，PCR检测对实验室条件和操作人员有一定的要求，且检测成本较高。因此，PCR不能替代血清学检测，只能作为血清学检测的补充。

2.4 脑脊液的检查：用于诊断神经梅毒，包括细胞计数、蛋白定量、VDRL、PCR检测和胶体金法。脑脊液细胞数和总蛋白量增加不是一种特异性反应，只有脑脊液VDRL试验才是神经梅毒的可靠性诊断依据[19]。

3 展 望

梅毒实验室检测技术众多，但是每种方法都存在一定的局限性，综合考虑利弊，不难得出血清学检测方法仍然是梅毒实验室诊断的主要方法，而且随着近几年分子生物学技术的快速发展，以重组抗原作为诊断抗原的特异、灵敏、快速、简便、低成本的血清学方法是发展趋势，但是目前重组抗原仍不能用于临床各期梅毒，需要进一步评价其他新的重组抗原在梅毒诊断中的意义，从而寻求一种在检测各期梅毒时灵敏度和特异度都能达到“金标准”所要求的百分比的重组抗原，这将为梅毒患者早发现、早诊断、早治疗带来前所未有的前景。

[1]Casal CA,Silva MO,Costa IB.Molecular detection of Treponema pallidum sp.pallidum in bloodsamples of VDRL-seroreactive women with lethal pregnancy outcomes:A retrospective observational study in northern Brazil[J].Rev Soc Bras Med Trop,2011,44(4):451-456.

[2]Sun R,Lai DH,Ren RX,et al.Treponema pallidum-specific antibody exepression for the diagnosis of different stages of syphilis[J]Chin Med J(Engl),2013,126(2):206-210.

[3]Aktas G,Young H,Moyes A,et al.Evaluation of the fluorescent treponemal antibody absorption test for Detection of antibodies( immunoglobulinsG and M) to Treponema pallidum in serologic diagnosis of syphilis[J].Int J STD AIDS,2007,18(4):255-260.

[4]Castro AR,Esfandiari J.Novel point of care test for simultaneous detection of nontreponemal and treponemal antibodies in patients with syphilis[J]J Clin Microbiol,2010,48(12):4165-4169.

[5]姜泽升.3种不同方法检测梅毒的结果比较分析[J].中外医疗,2011, 30(3):42-43.

[6]Castro R,Prieto ES,Joao Aguas M,et al.Evaluation of the Treponema pallidum particl agglutination technique (TPPA) in the diagnosis of neurosyphilis[J].J Clin Lab Anal,2006,20(6):233-238.

[7]Woznicova V,Valisova Z.Performance of CAPTIA select-syph-G enzymelinked immunosorbent assay in syphilis testing of a high-risk population: analysis of Discordant results[J].J Clin Microbiol,2007,45(6):1794-1797.

[8]Sun AH, Mao YF.Sensitive and specific ELTSA coated by TpN15-TpN17-TpN47 fusion protein for detection of antibodies to Treponema pallidum[J].Clin Chem Lab Med,2009,47(3):321-326.

[9]Nesa K,Alam A,chawdhury FA,et al.Field evaluation Of simple rapid tests in the diagnosis of syphilis[J].Int J STD/AIDS,2008,19(5):316-320.

[10]Lin LR,Tong ML,Fu ZG,et al.Evaluation of acolloidal gold immunochro matography assay in the detecTion of treponemapallidum specific IgM antibody in syphiLis serofast reaction patients a serologic marker for theRelapse and infection of syphilis[J].Diagn Microbiol Infect Dis,2011,70(1):10-16.

[11]Welch RJ,Litwin CM.Evaluation of two immunoblot assays and a Western blot assay for the detection of antisyphilis immunoglobuling antibodies[J].Clin VaccineImmunol,2010,17(1):183-184.

[12]Marangoni A,Sambri V. Evaluation of LIAISON Treponema Screen a novel recombinant antigen-based cheniluminescence immunoassay for laboratory diagnosis of syphilis[J].Clin Diagn Lab Immunol,2005,12(10):1231-1234.

[13]Smith BC,Simpson Y,Morshed MG,et al.New proteins for a new perspective On syphilis diagnosis [J].J Clin Microbiol,2013,51(1):105-111.

[14]Martin IE,TsangRs,Suthedandk,et al.Molecular Characterization of syphilis in patients in Canada aZithromycin resistance and detection of treponema pallIdum DNA in whole-blood samples versuswlcerative swus[J].J Clin Mierbiol,2009,47(6):1668-1673.

[15]Castro R,Prieto E,Aguas MJ,et al.Detection of Treponema palli-dum sp palliclum DNA in latent syphilis[J].Int J STD/ AIDS,2007,18(2):842-845.

[16]Mclver CJ,Rismanto N,Smith C,et al.Multiplex PCR testing detected higher than expected rates of cervical Mycoplasmas, Ureaplasmas,Trichomonas and viral Agents in sex ually active Australian women[J].J Clin MIcrobiol,2009,47(5):1358-1363.

[17]Scott LJ,Gunson RN,Carman WF.A new multiplex realtime PCR test for HSV1/2 and syphilis an evaluation of its impaction the laboratory and clinical setting[J].Sex Transm Infest,2010,86(7):537-539.

[18]Tipple C,Hanna MO,Hill S,et al.Getting the measure of syphilis:qPCR to better understand early infection[J].Sex Transm Infect,2011,87(6):479-485.

[19]Ratnam S.The laboratory diagnosis of syphilis[J].Can J Infect Dis Med Microbiol,2005,16(1):45-51.

R759.1

A

1671-8194（2015）07-0048-03

山西省软科学技术项目（编号：2011041073-02）

*通讯作者：E-mail： fwl192@hotmail.com