微小RNA作为感染性疾病标志物的研究进展

刘 冰， 张智晓， 刘 钢

·综述·

微小RNA作为感染性疾病标志物的研究进展

刘 冰， 张智晓， 刘 钢

微小RNA； 感染性疾病； 标志物

哺乳动物细胞内非编码RNA主要有短小干扰RNA(short interfering RNA，siRNA)、微小RNA(microRNA，miRNA)、核仁内小分子RNA(small nucleolar RNAs，snoRNA)等[1]。miRNA基因构成约3%人类基因组，而人类miRNA总基因数目有数千，据估计，单个的miRNA可调控数百到上千目标基因，因此，人类基因约30%～92%可能是由miRNA调控[2]。

1993年, Lee等[3]首先在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)体内发现了长度为22 nt的非编码小RNA——lin-4, 同时发现lin-4 RNA在lin-14基因的3′UTR(非翻译区)内存在着互补位点。进一步研究表明, lin-4 RNA通过与lin-14基因的3′UTR特异性结合降低了LIN-14蛋白的表达水平, 但对lin-14基因的mRNA水平影响并不显著,而lin-4 RNA便是现在所熟知的miRNA[4]。

miRNA是一类非编码小RNA,在不同的真核生物之间高度保守。miRNA通常编码于基因间，经过精细的转录和加工而成，由RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ转录产生初级产物[5]。pri-miRNA在核酸酶Drosha和其辅助因子Pasha的作用下被处理成由70个核苷酸组成的pre-miRNA, 经exportin 5等蛋白转运到细胞质中,另一个核酸酶Dicer将其剪切成约22个核苷酸长度的miRNA双链, 其中一条为成熟的miRNA分子, 成熟的miRNA分子在细胞内与Argonaute蛋白等形成RNA诱导的沉默复合体(RISC), 并作用于特异mRNA的3′UTR, 从而抑制翻译过程或直接降解mRNA[6]。

1 miRNA 在感染性疾病发生中的可能机制

miRNA在病原体-宿主相互作用中调节免疫应答呈复杂性、双向性。一方面，微生物编码的miRNA参与调节微生物在宿主体内的复制、存活，甚至损害宿主防御系统；另一方面，宿主合成自身miRNA，靶向作用于病原微生物毒力因子基因或者对病原微生物有关键作用的自身基因，以抑制病原微生物在体内增殖，参与抗微生物免疫[7]。

1.1 miRNA与脓毒症

脓毒症是指由感染引起的全身炎性反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，脓毒症的发生和发展与机体的免疫功能紊乱密切相关。因miRNA对机体免疫有特殊的调控作用，故在脓毒症发病机制的研究中受到越来越多的关注。

早期诊断脓毒症的标志物包括C反应蛋白、细胞因子(IL-l、IL-6、IL-10和TNFα)、趋化因子(IL-8、MPC-1和G-CSF)、降钙素原等，特别是降钙素原曾经被认为是脓毒症的潜在标志物[8]。但近来有文献称降钙素原不能区分脓毒症和非感染性的SIRS，因而不能作为诊断脓毒症的特定指标[9]。研究者对来自脓毒症、SIRS和正常人的血清中miRNA(miR-132、miR-146a、miR-155、miR-223、miR-15b、miR-126、Let-7i)进行分析，得出miR-146a和miR-223在脓毒症组中有明显的减少，受试者工作特征曲线(ROC)曲线下面积miR-146a、miR-223和IL-6各自为0.858、0.804和0.785，作为脓毒症新的诊断标志物，miR-146a和miR-223具有高特异度和高灵敏度[10]。

Vasilescu 等[11]首先对比了脓毒症患者白细胞miRNA 表达谱，发现在所有脓毒症患者中均出现变化的miRNA 有4 个，miR-150 和miR-342-5p下调，miR-182和miR-486上调。进一步研究发现血浆miR-150的含量与患者序贯性器官衰竭评分(SOFA) 分值呈负相关， 其中促炎因子TNFα 和抗炎因子IL-10、IL-18在脓毒症患者的血浆中均显著上升，其含量与miR-150 的血浆含量呈负相关，利用血浆IL-18 和miR-150 的比值，进一步可以区分miR-150 含量不同的脓毒症患者。

循环血液中miR-150、miR-146a和miR-223皆可作为脓毒症患者的血清标志物[12]。Wang等[13]研究证实，miR-146a可以作为区分脓毒症和非脓毒症的潜在标志物，有望用于临床脓毒症诊断。Wang 等[14]经过综合研究发现， 血液中miR-146a和 miR-223 含量能有效地区分感染和非感染原因导致的脓毒症和SIRS患者，当特异度为100%时，其灵敏度分别是63.3%和80%。

综上所述，脓毒症患者外周血中miR-146a、miR-223、miR-150和miR-342-5p含量减少，而miR-182和miR-486含量增加。

最近的研究表明，90%血清miRNA结合到蛋白质复合物，如Ago2，RNA结合蛋白核磷蛋白1 (NPM1) 和高密度脂蛋白[15]。这项研究证实了实验性脓毒症引起循环miRNA时间依赖性上调，这些miRNA有miR-16、miR-17、miR-20a、miR-20b、miR-26a、miR-26b、miR-106a、miR-106b、miR-195和miR-451。Wang等[16]的研究结论指出miR-16、miR-15a、miR-193b*和miR-483-5p与脓毒症的诊断相关。血清中6种miRNA(miR-223、miR-15a、miR-16、miR-122、miR-193b*和miR-483-5p)编码的蛋白质为脓毒症的标志物，该蛋白对脓毒症28 d病死率预测价值比SOFA和APACHE Ⅱ评分要高[17]。Roderburg等[18]的研究首次证实重症监护病房(ICU)患者的血清中miRNA测量值的预后价值。入院后的miR-150血清浓度与ICU脓毒症等患者的生存和长期生存均密切相关，低miR-150水平表示预后不良。

1.2 miRNA与结核

miRNA在机体抗感染免疫应答中发挥重要调节作用。幽门螺杆菌(Helicobaherpylori，HP)、沙门菌(Salmonella)、产单核细胞李斯特菌(L．monocytogenes，LM)、分枝杆菌等几种常见细菌感染免疫中，miRNA调节免疫应答机制研究也取得了重要进展。

不同的miRNA，如miR-29a、miR-155、miR-155*、 miR-125b、 miR-3179a和miR-147可以是用于诊断结核的潜在生物标志物，这些miRNA生物标志物已被一部分独立的科研团队所验证，但有待进一步确证[19]。Wu等[20]研究也证实miR-155、miR-155*可能是潜在的结核诊断的标志物。Wiwanitkit等[21]研究表明 miR-155、miR-155*是活动性结核很好的诊断标志物，并且miR-21在链霉素治疗肺结核中起到了重要的作用。Zhang等[22]研究证实miR-378、miR-483-5p、miR-22、miR-29c、miR-101和miR-320b 6种血清miRNA的测定可以区分肺结核患者和健康人群。Qi等[23]研究提示 miR-361-5p、miR-889、miR-576-3p可作为快速诊断结核感染潜在的非侵袭性分子标志物。Singh等[24]研究也提到miR-99B可能用于结核病的诊断和治疗。Spinelli等[25]研究中结核病患者胸腔积液的单核细胞中miR-223、miR-421、miR-144*表达下调，外周血中单核细胞的miR-424升高。有研究表明 miR-29a表达在肺结核感染、发病过程中可能起到重要作用[26]，在抗结核感染中也起到了重要的作用[27]。Yi等[28]研究进一步说明miR-29a在抗结核免疫反应中起到负向调节作用。

综合以上研究结果，miR-155、miR-155*作为结核诊断标志物的研究较多，而且miR-29a可能在结核诊断和治疗中起到重要的的作用。

1.3 miRNA与肝炎

肝脏中含有大量的miR-122，Bihrer等[29]从患有慢性丙型肝炎的患者和正常人中分别抽取血清进行miR-122检查，同时对患者组进行肝脏组织学检查，结果发现慢性丙型肝炎患者血清中miR-122水平明显高于正常对照组，并且miR-122水平与肝脏炎性反应程度指标具有相关性。因此，血清miR-122可作为慢性丙型肝炎坏死性炎性反应的生物标志物。还有研究小组研究了乙型肝炎患者以及乙肝病毒标志阳性的肝癌患者血清中miRNA。Li等[30]选取正常对照组210例，乙型肝炎患者135例，丙型肝炎患者48例，乙型肝炎病毒标志阳性的肝癌患者120例，使用 Solexa测序及实时定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)验证分析，结果发现16种有明显差异的miRNA，其中13种血清miRNA(miR-375、miR-92a、miR-10a、miR-223、miR-423、miR-23b、miR-23a、miR-342-3p miR-99a、miR-122a、miR-125b、miR-150、let-7c)可以作为乙型肝炎的生物标志物，3种可以作为乙型肝炎病毒标志阳性肝癌标志物的miRNA(miR-375、miR-25、let-7f)。

1.4 miRNA与神经系统感染

病毒性脑炎是世界各地常见的脑部病毒感染，并且可由多种病毒引起，如虫媒病毒、疱疹病毒，甚至艾滋病病毒。其中，1型单纯疱疹病毒(HSV-1)具有嗜神经性，能引起感染并且终身潜伏在神经组织。与阿尔茨海默病类似，HSV-1感染与炎性反应信号显著上调相关，其中花生四烯酸的一个特定成员的表达增加已有报道。有研究也报道了在宿主的免疫调控和炎性反应中miR-146a的作用[31]。Provost[32]研究显示miR-342-3p可能成为动物和人类朊蛋白病的新型标志物。

2 检测方法

miRNA检测方法大体可以归为2类：一类是不需要样本扩增的探针直接杂交法；另一类是基于样本的miRNA扩增法[33]。

检测循环miRNA的方法主要有：高通量测序法、miRNA芯片法、Northern blot 法、qRT-PCR 法。新一代的测序技术在序列未知的情况下可以对miRNA进行分析，在此基础上发现和鉴定新的miRNA分子，但测序法价格昂贵，不适合普通实验室开展。miRNA芯片是通过对样本中已知miRNA序列进行的研究，得出特定的表达谱，但很难区分前体miRNA和成熟miRNA，所以芯片结果需要用qRT-PCR 进行确认。Northern blot 法步骤烦琐，需要较多的样本且灵敏度较低，不适合大批量临床样本检测。qRT-PCR 是研究miRNA最常用的方法，可以对循环miRNA定性或者定量检测，此法操作简便、快速，且具有较高的灵敏度和特异度[34]。

3 应用前景

大量的研究表明，miRNA控制一些重要的病理生理过程，如细胞增殖、黏附、凋亡和血管生成。miRNA深度测序的最新发展已经改变了miRNA的身份，特别是那些有潜在诊断或预后价值的miRNA[35]。

病毒利用miRNA调节自身和宿主细胞的基因表达，因此利用反义寡核苷酸对抗病毒miRNA或宿主细胞miRNA，可以作为抗病毒的治疗策略。miRNA干扰途径可以通过合成与pri-miRNA、pre-miRNA或成熟miRNA分子完全互补的抗miRNA反义寡核苷酸(anti-miRNA oligonucleotides, AMO)分子来实现。目前最有效的AMO为与成熟miRNA分子完全互补的AMO分子[36]。Iannaccone等[37]研究表明抗miRNA物质和miRNA类似物对感染、炎性反应和恶性疾病中异常miRNA的调节有望成为相应疾病有效的治疗措施。

miRNA介导的基因沉默技术是治疗病毒感染性疾病的一个很有发展潜力的手段。但是miRNA作为基因治疗方法要应用于临床治疗，仍有很多技术问题需要解决。例如一些miRNA的识别靶点因其二级结构或高度褶叠而被遮盖，一些mRNA与蛋白质形成复合物而隐藏了其miRNA序列的识别位点，还有如何准确地将miRNA投送入感染细胞中等[38]。

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Research update of microRNA as a marker of infectious diseases

LIU Bing, ZHANG Zhixiao, LIU Gang

. (Department of Infectious Diseases, Children′s Hospital, Capital Medical University, Beijing 100045, China)

首都医科大学附属北京儿童医院感染科，北京 100045。

刘冰(1991—)，男，首都医科大学2009级七年制临床医学(儿科方向)学生。

刘钢，E-mail：liugang10@hotmail.com。

R51

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1009-7708(2015)04-0391-04

2014-07-23

2014-09-22