猕猴桃藤总黄酮纯化工艺研究△

李雪，李栋红，王小平，白吉庆

(陕西中医学院，陕西 咸阳 712046)

·基础研究·

猕猴桃藤总黄酮纯化工艺研究△

李雪，李栋红，王小平*，白吉庆

(陕西中医学院，陕西 咸阳 712046)

目的：猕猴桃藤中总黄酮纯化工艺的优选。方法：采用单因素设计，以总黄酮的含量为评价指标。结果：最佳纯化条件样品与聚酰胺的比例为1∶10，10倍量柱体积的60%乙醇洗脱，所纯化的总黄酮含量最高，可达51.8%。结论：该纯化工艺简单、可行，可用于猕猴桃藤中总黄酮的纯化。

猕猴桃藤；总黄酮；纯化工艺；正交设计

猕猴桃藤为猕猴桃科猕猴桃属植物猕猴桃ActinidiaChinensisPlanch.的藤[1]。猕猴桃根具有清热解毒、活血散结、祛风利湿之功能。临床上用于治疗胃癌、乳腺癌、风湿性关节炎、淋巴性结核、跌扑损伤、痈疖等病[2]。我国为猕猴桃的主要产区，陕西省广泛栽培，栽植面积占全国60%以上。近年发现中华猕猴桃根富含黄酮类、生物碱类等成分，具有降压、抗肿瘤等药理作用[2-5]。猕猴桃根资源相对匮乏，但其藤因为果农每年都要修剪，资源非常丰富。前期研究发现猕猴桃藤富含大量黄酮类成分，但对其总黄酮纯化工艺研究报道较少，因此本文对其总黄酮的纯化工艺进行研究，希望为猕猴桃藤总黄酮的开发利用提供参考。

1 仪器与试剂、试药

1.1 仪器

紫外-分光光度计(上海美普达仪器有限公司)；德国IKA RV10旋转蒸发仪；KQ-300VDE型双频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；DZF-6050B真空干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)；101-2型电热鼓风干燥箱(北京科伟永兴仪器有限公司)；BT125D电子天平(赛多利斯)。

1.2 试剂、试药

猕猴桃藤，经陕西中医学院生药教研室白吉庆副教授鉴定为猕猴桃科猕猴桃属植物猕猴桃ActinidiaChinensisPlanch.的藤；芦丁对照品(中国食品药品检定研究院提供，批号：100080-200707)；聚酰胺(100～200目)；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醇等均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 粗提物制备 称取猕猴桃藤藤饮片150 g，用8倍量60%的乙醇提取3次，每次1 h，合并滤液，减压回收乙醇至稠膏状，减压干燥，得粗提物14.64 g。

2.1.2 对照品的制备 精密称取芦丁对照品9.93 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2 标准曲线的绘制

分别取芦丁对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL于10 mL容量瓶中，精密加入5%的亚硝酸钠溶液0.4 mL，摇匀，放置6 min；加入10%硝酸铝溶液0.4 mL，摇匀，放置6 min；加入4.3%的氢氧化钠试液4 mL，加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，用紫外-可见分光光度法，在500 nm波长处测吸收光度。以总黄酮(芦丁计)浓度为纵坐标，吸光度为横坐标，进行线性回归，绘制标准曲线，得Y=0.008 73X-0.002 8(r=0.999 9)，总黄酮(芦丁计)在0.01～0.08 mg·mL-1线性关系好良好[6]。

2.3 上柱溶液的制备

称取粗提物适量置烧瓶中，精密加入10倍量60%的乙醇，称定重量，超声20 min，取出，室温放置，称重，用60%的乙醇补足减失的重量，过滤，滤液备用。

2.4 纯化工艺考察

2.4.1 洗脱量的考察 取供试品2 g(平行3份)，精密称定，按照2.3项下的方法制备上柱溶液，加到已处理好的聚酰胺(10 g)柱上(30 cm×5 cm)，分别用6、8、10、12倍量柱体积的60%乙醇洗脱，收集洗脱液，摇匀，精密量取0.3 mL置10 mL容量瓶中，照2.2项下的方法自加入5%的亚硝酸钠0.4 mL起，依法测定吸光度。代入标准曲线，计算总黄酮的浓度。精密量取洗脱液适量，置干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105 ℃烘3 h，取出，置干燥器中冷至室温，精密称重。计算所得纯化物中总黄酮的含量分别为31.6%、40.5%、49.2%、42.8%。

2.4.2 洗脱浓度的考察 取供试品2 g(平行3份)，精密称定，按照2.3项下的方法制备上柱溶液，加到已处理好的聚酰胺(10 g)柱上(30 cm×5 cm)，用10倍量柱体积的50%、60%、70%、80%乙醇洗脱，收集洗脱液，摇匀，精密量取0.3 mL置10 mL容量瓶中，照2.2项下的方法自加入5%的亚硝酸钠0.4 mL起，依法测定吸光度。代入标准曲线，计算总黄酮的浓度。精密量取洗脱液适量，置干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105 ℃烘3 h，取出，置干燥器中冷至室温，精密称重。计算所得纯化物中总黄酮的含量分别为32.4%、48.6%、39.2%、40.6%。

2.4.3 上样量的考察 分别取供试品1、2、3 g(平行3份)，精密称定，按照2.3项下的方法制备上柱溶液，加到已处理好的聚酰胺(10 g)柱上(30 cm×5 cm)，分别用10倍量柱体积的60%乙醇洗脱，收集洗脱液，摇匀，精密量取0.3 mL置10 mL容量瓶中，照2.2项下的方法自加入5%的亚硝酸钠0.4 mL起依法测定吸光度。代入标准曲线，计算总黄酮的浓度。精密量取洗脱液适量，置干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105 ℃烘3 h，取出，置干燥器中冷至室温，精密称重，计算所得纯化物中总黄酮的含量分别为51.8%、48.5%、46.4%。

2.5 结果

试验结果表明，最佳纯化条件为样品与聚酰胺的比例为1∶10，10倍量柱体积的60%乙醇洗脱。

2.6 工艺验证

取供试品5 g(平行3份)，精密称定，按照2.3项下的方法制备上柱溶液，加到已处理好的聚酰胺(50 g)柱上(30 cm×5 cm)，分别用10倍量柱体积的60%乙醇洗脱，收集洗脱液，摇匀，精密量取0.3 mL置10 mL容量瓶中，照2.2项下的方法自加入5%的亚硝酸钠0.4 mL起，依法测定吸光度。代入标准曲线，计算总黄酮的浓度。精密量取洗脱液适量，置干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105 ℃烘3 h，取出，置干燥器中冷至室温，精密称重，计算所得纯化物中总黄酮的含量分别为51.6%，52.5%，50.9%，表明优选的纯化工艺稳定可行。

3 结论与意义

采用薄层色谱法，猕猴桃藤粗提物色谱中在与芦丁对照品相应的位置出现相同的斑点，表明猕猴桃藤粗提物中含有芦丁，故本文选择芦丁作为对照品测定猕猴桃藤粗提物纯化前后总黄酮的含量。本文采用单因素试验，筛选影响猕猴桃藤粗提物中总黄酮纯化效果的主要因素，并对优化的纯化工艺进行放大试验验证，为猕猴桃藤总黄酮工业化生产及开发利用提供参考。

本试验以芦丁为对照品，用紫外-分光光度法对总黄酮进行含量测定，通过聚酰胺柱层析对猕猴桃藤中总黄酮纯化效果进行筛选。结果表明，样品与聚酰胺的比例为1∶10，洗脱剂为10倍量柱体积60%的乙醇，所得纯化物中总黄酮含量最高，可达51.8%。本试验对优化的工艺进行放大试验验证，结果纯化效果较为理想，纯化后总黄酮的含量可高达50%以上，与单因素考察所得的最佳纯化效果进行比较，无显著差异。该纯化工艺简单、可行，重复性好，可用于猕猴桃藤中总黄酮的纯化。

[1] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草：第九卷(第三册) [ M].上海：上海科学技术出版社，1999.

[2] 赫军，马秉智，赵铁.藤梨根的化学成分研究[J].中国药学杂志.2014，49(3)：184-186.

[3] 邸学，海波，杨欣欣.藤梨根药材HPLC指纹图谱及质量研究[J].中国实验方剂学杂志.2013，19(10)：135-137.

[4] 龙凯花，王小平，白吉庆.中药藤梨根抗肿瘤研究[J].中国现代中药，2013，15(10)：846-849.

[5] 邸学，徐洋洋，裴世柱.响应面法优化藤梨根总生物碱提取工艺[J].辽宁中医药大学学报.2013，15(7)：58-61.

[6] 王小平，白吉庆.藤梨根总黄酮提取方法及含量测定研究[J].陕西中医学院学报，2008，31(3)：65-66.

Purification Process of total flavonoids in Vine ofActinidiachinensis

LI Xue，LI Donghong，WANG Xiaoping*，BAI Jiqing

(Shaanxi University of TCM, Xianyang 712046，Shaanxi，China)

Objective：To optimize of flavonoids purification process ofActinidiachinensisvine.Methods：The optimized The purification process of the flavonoids was optimized with the total flavonoids as a index.Results：Optimal purification process was as following: The ratio of samples and adsorbent 1∶10, tenfold column volumes of 60% ethanol elute, the content of total flavonoids was 71.8%.Conclusion：The purification process is simple and feasible, and can be used for purification of total flavonoids in vine ofA.chinensis.

Vine ofActinidiachinens；total flavonoids；purification process；orthogonal design

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.2.010

2015-01-28)

陕西省科技资源统筹中药现代化专项(2012KTCL03-14)；陕西省大学生创新训练项目(1689)

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王小平，副教授，硕士生导师，研究方向：中药质量分析与新药研究；E-mail：wangxiaoping323@126.com