人胶质瘤组织中miR-125b表达研究

2015-01-22 02:48解建国娟娟
神经损伤与功能重建 2015年4期

解建国,娟娟

神经胶质细胞瘤简称胶质瘤,是临床中神经外科常见的原发性颅内肿瘤疾病[1],严重影响患者生命质量,恶性胶质瘤患者约占60%。临床治疗中,采取联合放疗、手术及化疗的方法,也不能有效遏制恶性胶质瘤,患者确诊后生存期仅9~12个月[2]。当前研究发现,癌基因及抑癌基因均与胶质瘤的发生有一定关联,但还未阐明胶质瘤的发生机制[3,4]。本实验采用荧光定量PCR技术检测miR-125b在胶质瘤组织中的表达,报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集不同恶性程度胶质瘤手术患者20例为胶质瘤组,其中Ⅰ级5例、Ⅱ级5例、Ⅲ级5例、Ⅳ级5例。另选择临床实施脑外伤内减压手术的患者5例,为正常对照组。

1.2 试剂与仪器

Heraeus台式高速离心机、Virtis型内切式组织匀浆机、Trizol试剂(购于美国Invitrogen公司)、Roche Real-time PCR仪(购于瑞士Roche公司)、反转录试剂盒 PrimeScript TM RT reagent Kit、Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)试剂盒(购于美国Sigma公司)、Light Cycler平台(购于瑞士Roche公司)。

1.3 方法

在手术中取下胶质瘤组胶质瘤组织和正常对照组的正常脑组织标本后,放入液氮中存储。

1.3.1 总RNA提取 收集脑组织140 mg,按照Trizol试剂盒说明书提取总RNA。整个过程在冰上操作,使用的枪头等均必须用DEPC处理。总RNA的质量和浓度使用紫外分光光度仪上检测。

1.3.2 cDNA合成 取1.5 μL的Prime-ScriptTM RT Enzyme Mix Ⅰ,1.5 μL 的 PrimeScriptTM Buffer,以及1.5 μL的Oligo dT Primer,并且对于每个标本,还取总1.0 μg的microRNA,加20 μL无RNA酶水。在37℃下,进行反转录反应15 min,在85℃下逆转录5 s,反转录酶失活后将其置于-80℃中保存。

1.3.3 Real-time PCR扩增反应 本研究主要在Light Cycler平台上进行反应试验,其中,反应体系总量为20 μL:10 μL 2×Premix Ex TaqTM 液,1 μL 带 Taq-Man 探针 Primer,1 μL 不同浓度 cDNA 模板,1 μL 50×Rox Reference DyeⅡ溶液,以及 7 μL 试验用灭菌蒸馏水。反应条件:37℃孵育15 min,85℃反应5 s。合成好的cDNA置于-80℃保存备用。共45个PCR循环(95℃,10 s;60℃,60 s)。在每个循环的延伸阶段收集荧光引号。每个样本重复4次,并且使用2-△△CT法检测 miR-125b 相对表达量[5]。

1.3.4 预后随访 出院后,通过电话和门诊随访患者术后症状变化等情况。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 miR-125b的相对表达量

正常对照组的miR-125b相对表达量为(0.28±0.12),胶质瘤组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级相对表达量分别为(0.43±0.07)、(0.69±0.08)、(0.90±0.05)、(1.12±0.04),差异有统计学意义(P<0.05),见表 1、图 1。

2.2 随访结果

术后平均随访26月(7~42月),其中死亡14例,无失访。术后生存期与肿瘤病理恶性程度别具有相关性,恶性程度越高,生存期越短(P<0.05),见图 2。

3 讨论

微小 RNA(microRNA,miRNA)是一类长度为19~25个核苷酸的短核糖核酸分子,也是一类进化上保守、稳定的非编码调控单链小分子RNA[6]。调控miRNAs,作为转录后调控中的一个基本因素,主要可通过调控靶基因转录之后的翻译水平,参与脑组织细胞死亡、代谢等生理过程。有些miRNA和肿瘤有一定关联,并且某些miRNA还可发挥抑癌基因的效果。近年来,国外有大量文献报道研究显示miRNA与胶质瘤发生有关[7]。miR-125b在某些肿瘤中发挥癌基因作用,在另一些肿瘤中发挥抑癌基因作用,miR-125b的这一特点反映了肿瘤的不同致病机制。miR-125b主要在胚胎、成人脑组织的海马区大量分布,微阵列技术表明在胶质瘤细胞系中miR-125b低表达。既往研究表明,miR-125b属于脑组织高表达的miRNA,在P19畸胎瘤细胞向神经元分化过程中表达显著增加,提示miR-125b可能参与调控神经元的分化和脑组织发育[8]。有研究显示,miR-125b在肿瘤中有重要的调控作用,如肺癌、乳腺癌、前列腺癌等组织中,miR-125b表达水平均降低[9-11]。然而下调miR-125b能促进肿瘤增殖和生长,而在有些肿瘤中呈高表达,例如胰腺癌、膀胱癌等[12,13]。国外有研究显示,miR-125b在正常人脑组织中表达水平相对较低,而在胶质瘤患者中表达明显上调[14,15]。本研究发现正常对照组的miR-125b相对表达量为(0.28±0.12),胶质瘤组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级相对表达量分别为(0.43±0.07)、(0.69±0.08)、(0.90±0.05)、(1.12±0.04),差异有统计学意义(P<0.05)。因此,miR-125b在胶质瘤中表达水平明显比在正常组织中增高,并且随着恶性程度越增加,其表达也逐渐增高。本研究发现术后生存期与肿瘤病理恶性程度具有相关性,恶性程度越高,生存期越短(P<0.05)。综上所述,胶质瘤体内高miR-125b表达水平提示较早的肿瘤复发率,与预后不良有关,这为研究miR-125b表达水平下调的机制、表达水平和肿瘤预后的关系,为利用miR125b对胶质瘤的诊断和个性化治疗打下基础。

表1 不同组织miR-125b的相对表达量

图1 不同组织miR-125b的相对表达量

图2 胶质瘤组不同级别患者的生存期分析

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