高效液相色谱法在抗生素药品有关物质分析中的应用

刘拴娣，赵媛媛

（1.内蒙古医科大学附属医院，内蒙古 呼和浩特 010050； 2.内蒙古自治区武川县医院，内蒙古 呼和浩特 011700）

高效液相色谱法在抗生素药品有关物质分析中的应用

刘拴娣1，赵媛媛2

（1.内蒙古医科大学附属医院，内蒙古 呼和浩特 010050； 2.内蒙古自治区武川县医院，内蒙古 呼和浩特 011700）

抗生素是临床使用最广泛的药品，其质量优劣直接关系着临床使用的安全性和有效性，其有关物质的质量控制与临床不良反应密切相关。高效液相色谱（HPLC）法为抗生素杂质检查最常用的方法，具有简便、快捷、准确等优势。该文总结了HPLC法在抗生素药品含量测定及有关物质检查中的应用。

高效液相色谱法；抗生素；有关物质

药品的质量与疗效不仅与药品本身固有的生物活性有关，还与药品中的杂质成分有关。抗生素药品因制备工艺、化学结构及组分等方面的特殊性，决定了其杂质更复杂。抗生素药品中有关物质通常是指原料药和制剂中的有机杂质，有关物质检查在抗生素药品质量控制中占有重要地位。由于各类抗生素半衰期不同，在存放时可能出现微量或痕量杂质，故选择高效液相色谱（HPLC）法测定其有关物质临床意义重大。目前，HPLC是检查抗生素药品中有关物质最常用的方法，具有简便、快捷、准确等优势。

1 β－内酰胺类

β-内酰胺类抗生素是抗生素药品中极易因杂质引起过敏性反应的一类，其主要杂质有高分子聚合物、降解物及异构体等。王建等[1]采用梯度洗脱的方法检测了盐酸头孢他美酯中的有关物质，该方法实现了盐酸头孢他美酯与中间体、分解产物及二聚物的完全分离，与2010年版《中国药典（二部）》所载方法比较，检出了更多杂质峰，且避免了主要杂质头孢他美酸出峰快且易受溶剂峰和辅料峰等干扰的缺点。

李进等[2]比较了2010年版《中国药典（二部）》和34版《美国药典》中头孢地尼有关物质的分析方法，对2种系统分离的杂质进行了相互识别和追踪，结果6种主要有关物质色谱保留行为基本一致。从头孢地尼合成工艺角度出发，对2010年版《中国药典（二部）》中头孢地尼有关物质分析方法进行了进一步优化，优化后的新方法解决了乙酰化头孢地尼和反式头孢地尼2种杂质的分离问题。

刘成红等[3]对95家生产企业共380批次头孢拉定胶囊中的有关物质进行了检测，所建立的方法可有效分离与检测各杂质峰，且更利于7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸和双氢苯苷氨酸杂质峰的判别。测定结果显示，2010年版《中国药典（二部）》标准关于头孢拉定原料与胶囊有关物质单个杂质限度明显偏高，建议调整头孢拉定胶囊中4′，5′-双氢头孢拉定峰面积、其他单个杂质峰面积（除头孢氨苄和4′，5′-双氢头孢拉定）及杂质总峰面积（除头孢氨苄）等规定。

周冉等[4]比较了国家食品药品监督管理总局(CFDA)发布的注射用盐酸头孢替安标准及盐酸头孢替安碳酸钠混合粉标准下色谱系统的适应性，结果采用磷酸盐缓冲体系测定盐酸头孢替安有关物质，各杂质与主峰间的分离效果更好。

钟莹等[5]测定了注射用头孢地嗪钠的有关物质，建立的梯度洗脱法具有更强的杂质分析能力，样品中各成分的分离度及检出灵敏度均满足有关物质限度的测定要求，可有效评价产品的质量。

郭艳娟等[6]采用梯度洗脱方法对国内10个厂家生产的注射用头孢唑肟钠样品进行了有关物质检查，此方法灵敏度较高、分离效能较好，检出杂质的个数和总量均较现行法定标准多。

施洁明[7]建立了测定注射用硫酸头孢匹罗中有关物质的梯度洗脱方法，该方法中头孢匹罗与头孢噻肟酸（CME-I）、7-ACA、2-巯基苯并噻唑（2-MBT）和2，3-CYCPP间分离完全。

由表4可见，揉捻压力、次数、时间3个因素均影响卷曲形茶做形效果，其中，揉捻压力的影响最大，次数和时间的影响较小。由于3个因素的F值和P值均未达显著水平，说明，3者对总体品质的影响都不显著。

张姮婕等[8]测定了注射用头孢他啶中的有关物质，采用梯度洗脱方法可从样品中分离出21个杂质，且各杂质间具有良好的分离度。

彭力等[9]建立了美洛西林钠有关物质测定方法，采用梯度洗脱方式，主峰与所有有关物质峰均达到基线分离，且分离度较好。

陈希等[10]采用2010年版《中国药典（二部）》中青霉素Ⅴ有关物质的测定方法，考察了青霉素V钾片及胶囊中水分含量与有关物质间的相关性，结果水分和有关物质呈正相关。

陈汝红[11]系统地对苄星青霉素中有关物质测定条件进行了考察，最终确立的方法专属、灵敏；与欧洲药典所载样品溶解方法及色谱条件相比，克服了诸多不足。

任凤英等[12]对头孢他美钠有关物质测定条件进行了系统考察，最终确立的色谱条件专属性强，有关物质与主峰间均能完全基线分离。

阮丹等[13]分别测定了盐酸头孢甲肟原料药及注射用盐酸头孢甲肟有关物质，建立的梯度洗脱方法可检出更多主峰后的杂质，且主峰及各杂质峰间分离度良好。

上官丹罡等[14]综述了头孢哌酮钠及其复方制剂在合成、贮存及使用过程中可能产生的有关物质，并介绍了已知化学结构的有关物质。头孢哌酮钠及其复方制剂有关物质常用分析方法为反相高效液相色谱法，其他分析方法有分子排阻色谱法、胶束电动毛细管色谱法(MEKC)等。

2 大环内酯类

目前，临床应用的大环内酯类抗生素中，阿奇霉素、罗红霉素和红霉素等第1代，第2代大环内酯类应用非常广泛，但随着多种耐药菌的出现，第3代大环内酯类抗生素也逐渐投入临床。大环内酯类抗生素的有关物质按来源可分为工艺杂质类和降解杂质类。黄珊等[15]就大环内酯类药物杂质来源、分类及杂质谱的建立进行了详细综述。

张斗胜等[17]采用2010年版《中国药典（二部）》阿奇霉素原料有关物质检查法，考察了国产阿奇霉素颗粒中常用的20种辅料对现行阿奇霉素杂质HPLC法分析的干扰作用。结果表明，国产阿奇霉素颗粒剂处方中添加的辅料不影响测定。

柏大为等[18]建立了注射用阿奇霉素枸橼酸二氢钠有关物质的测定方法，该方法较国家部颁标准具有简便、准确、专属性强等优点，有关物质峰（降解产物峰）与主成分峰均达到基线分离，可用于阿奇霉素有关物质的检测。

曾红霞等[19]通过强力破坏试验及质谱检测，确定了罗红霉素颗粒和干混悬剂中的降解产物为去红霉糖罗红霉素，并建立了去红霉糖罗红霉素的检测方法，可为罗红霉素颗粒和干混悬剂有关物质的检查提供参考。

3 氨基苷类

氨基苷类抗生素分子结构中无发色团，无法采用紫外线吸收(UV)法检测，目前有关物质的检测方法多采用柱前或柱后衍生化方法、蒸发光检测器（ELSD）及脉冲安培电化学检测器（PAD），流动相的选择多采用可挥发性盐三氟乙酸（TFA）系统。

秦峰等[20]建立了 PAD检测法测定庆大霉素的 C组分及其有关物质的分析方法，同时平行采用 2014版英国药典（BP）的电化学方法测定有关物质含量，结果2种方法的测定结果基本一致。

王琰等[21]建立了盐酸大观霉素含量及有关物质PAD测定方法，该方法采用较有优势的TFA作为流动相、四电位的工作模式进行电化学检测，并进行了全面的方法学考察，各主要杂质色谱峰间的分离度均符合规定。

刘英等[22]比较了2010年版《中国药典》和2014版英国药典（BP）中收载的2种测定硫酸庆大霉素中的组分及其有关物质方法，结果2010年版《中国药典》所载ELSD法能更有效地分离西索米星及其相邻杂质，同时杂质峰的检出个数和灵敏度均较英国药典PAD法有所增加。

张凤妹等[23]采用UV末端吸收（200 nm）法测定硫酸阿米卡星及注射液的有关物质，杂质成分除卡那霉素（杂质D）外均无法检出，需采用薄层色谱(TLC)法另行控制，其余各成分的分离情况良好。

孙晶等[24]采用柱前衍生化对依替米星有关物质进行检查，并运用LC-TOF／MS和LC-MS／MS鉴定主要有关物质，方法的专属性、灵敏度和准确度均较高，衍生化产率更高、产物更稳定。通过结构鉴定将依替米星有关物质分为依替米星同系物、糖苷键断裂的降解产物、具有C=C双键的有关物质、氨基被羟基取代的有关物质4类。

朱晓 等[25]采用PAD检测法对硫酸依替米星氯化钠注射液中有关物质进行测定，所建立的方法能使主成分依替米星与中间体及主要杂质之间有效分离，但仍有部分杂质及依替米星与后相邻峰之间不能达到基线分离。同时，建立了ELSD法测定硫酸依替米星氯化钠注射液有关物质的方法，改善了因样品稀释溶剂造成的峰形裂分[26]。对比PAD法测定结果，2种方法测得的单个最大杂质结果比较接近，但PAD法测得的杂质个数及总量均比ELSD法要高。

4 其他

HPLC法在四环素类、林可酰胺类抗生素及抗肿瘤抗生素有关物质的检查中均为常用测定方法。土霉素的有关物质采用主要杂质对照品定位来控制，顾云等[27]建立土霉素二水物有关物质的测定方法，结果杂质峰之间、杂质与主峰之间均能分离良好，方法专属性较好。

黄萍等[28]采用HPLC法对四环素片中四环素及异构体进行分析，结果四环素、4-差向四环素、土霉素、脱水差向四环素和脱水四环素5种组分的分离均符合规定。

张菁等[29]测定了盐酸林可霉素滴眼液有关物质，建立的方法专属性较好，林可霉素与相邻杂质之间分离度良好，防腐剂峰并不干扰有关物质的测定。

王建等[30]建立了测定盐酸克林霉素棕榈酸酯原料药、分散片、颗粒及干混悬剂有关物质的方法，采用UV法进行检测较示差折光法检测可检出更多主峰后的杂质，且克林霉素棕榈酸酯与10种合成中间体、副产物完全分离。

梁键谋等[31]测定了克林霉素磷酸酯及其注射剂的有关物质，所建立的方法较国家标准（YBH09502003）方法，对克林霉素磷酸酯各相关杂质的检出与分离明显更有效。

鲁瑞娟等[32]测定了盐酸博来霉素组分博来霉素A2和博来霉素B2的含量，且A2及B2分别与相邻杂质峰的分离符合规定。

5 结语

抗生素质量分析主要有色谱法、化学发光法、荧光法、近红外光谱法及电化学法等。目前，HPLC法作为抗生素质量分析最常用的手段，如ELSD、电化学检测器（ECD）等新检测器及新型色谱柱填料的应用，为抗生素的质量控制提供了更准确的分析方法。抗生素因其所含杂质种类与杂质含量均比普通合成化学药物复杂，对于抗生素杂质的控制，一般包括每个明确的已知杂质、每个明确的未知特定杂质、任何非特定杂质（不超过鉴定限度）及总杂质。近年来，色谱联用技术尤其HPLC-MS技术在抗生素杂质鉴定方面应用逐渐增多，MS技术对于母核结构基本已知的化合物的结构推测较准确，可为杂质归属为母体化合物或某侧链等有关物质提供充分证据。

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R927.1；R978.1

A

1006－4931(2015)23－0255－03

刘拴娣，女，副主任药师，研究方向为药学，（电子信箱）269816429＠qq.com。

2015－08－13)