啮齿类血管性痴呆动物模型

王群，王拥军

由脑血管因素引起脑组织血液供应障碍导致的脑功能衰退，表现为认知功能缺损，统称为血管性痴呆（vascular dementia，VD）[1]，亦称血管性认知障碍（vascular cognitive impairment，VCI）[2]。VD不是一个单一的疾病，而是一类综合征，大、小动脉病变，弥漫性缺血性白质病变，心脏脱落栓子的栓塞，血流动力学改变，出血，血液学因素和遗传性疾病等不同的血管病理变化均可引起VD症状。流行病学研究显示在欧洲和北美，VD是继老年性痴呆（Alzheimer’s disease，AD）之后引起老年期痴呆（60%～70%）的第二病因，在所有痴呆中占15%～20%。随着人口老龄化的进展及脑血管病发病率的增加，VD有可能成为痴呆的第一病因[3]。由于VD被认为是唯一可以治疗的痴呆类型，但其发病的确切病理生理机制尚不明了，建立可靠的VD动物模型是研究VD发病机制、干预治疗、药物筛选及评价的关键，具有积极的临床意义[4]。

脑部反复缺血再灌注和长期慢性低灌注是VD的主要原因[5-6]。临床上双侧颈内动脉和单侧椎动脉闭塞的患者表现有亚急性的行为异常、认知缺陷和额叶脑血流减低，颅内-颅外血管旁路移植术后脑血流和认知功能明显改善，支持脑低灌注引起VD的概念[7]。动物研究发现，慢性脑低灌注导致痴呆样认知损害，大脑海马神经元损伤，额叶皮层下白质损伤，脑淀粉样蛋白沉积，小血管病变或微循环障碍和突触可塑性改变可能是血管性痴呆的病理基础。因此，动物反复脑缺血再灌注引起大脑慢性低灌注是制作VD较理想的动物模型[5-6]。

理想的VD动物模型应符合以下要求：①病理机制与人类相似；②动物存活时间长；③明显的中枢神经元损伤；④行为学指标异常并易于进行认知功能的评价；⑤动物来源方便；⑥造模方法具有可行性。一个理想的动物模型应该能够满足上述几点要素。但目前尚无一种模型能达此要求。在VD实验动物的选择方面，非人类灵长类是最好的模型，因其脑内血管结构、走向，充足的脑回和广泛的白质与人类最为接近[5]。然而，大多数的实验选用啮齿类小型动物如大鼠、小鼠或沙鼠，原因是价格较低和容易被伦理组织接受。沙鼠和某些种系小鼠因为缺乏后交通动脉及完整的基底动脉环，两侧大脑供血相对独立，通过闭塞侧或双侧颈总动脉（common carotid artery，CCA）即可复制效果明显的全脑缺血模型，但因为体型小，难以监测各种生理和复杂的行为学指标，应用亦不太广泛。目前，VD模型主要以大鼠为主，大鼠的脑血管分布与人类酷似，均由颈动脉系及椎基底动脉系在脑底吻合成动脉环，通过分支共同完成脑供血；同时，大鼠经济易得、易存活，便于进行动物智能测试及电生理检查。因而大鼠是建立VD模型最适合的动物。

目前大鼠VD动物模型众多，各有优缺点，理想的VD模型要求动物存活时间长且有明显的中枢神经元损伤及公认的行为学指标异常。制作方法可参考缺血性卒中模型制作部分，根据制作方法不同归纳为以下4种类型：血管阻断VD模型（vessel occlusion VD model）、血管内栓塞VD模型（多发性脑梗死VD模型）、光化学诱导VD模型、自发性VD模型。

1 血管阻断VD模型

1.1 四血管阻断法 目前国际公认的VD造模方法之一为改良的Pulsinelli四血管阻断全脑缺血法[8-9]：通常是先用电凝针阻断双侧椎动脉造成永久性闭塞，然后分离双侧CCA，穿结备用。24 h后用微动脉夹夹闭双侧CCA 5 min，共夹闭3次，每次间隔1 h，最终制备成全脑反复缺血再灌注模型。该模型的优点为：制作过程与VD的发病机制（反复脑缺血）相接近；病理改变较为充分、明确，海马损伤明显；可显示学习、记忆等认知功能的减退；缺血后生理指标稳定，无明显的肢体运动障碍。但是手术复杂，制作有一定的难度，并且由于双侧椎动脉的灼闭使脑干的血液供应受到了很大的影响，导致实验动物的生命中枢受到了抑制，动物的死亡率相对较高。

1.2 三血管阻断法 Kameyama等[10]首先报道了三血管阻断脑缺血再灌注模型。先用电凝切断大鼠基底动脉，用动脉夹夹闭两侧CCA，通过阻断与开放双侧CCA，实现全脑缺血再灌注模型的制备。优点是：缺血较为迅速，缺血效果好，再灌注血流恢复迅速，比较适用于急性全脑缺血性疾病损伤的研究；模型稳定性好，可通过阻断CCA的时间长短来控制缺血程度，模型成功率高。但是需要开颅，暴露基底动脉，手术创伤大，在手术中对周围组织、神经牵拉较严重；在暴露及夹闭基底动脉时，易损延髓，操作不当易造成动物死亡。

1.3 两血管阻断法 双侧CCA永久性结扎的脑缺血模型比较简单[6，11-12]，即分离双侧CCA，用线将其永久性结扎，缝合伤口。该模型是一种慢性低灌注模型，可导致脑组织的渐进性损害[11]，使学习记忆损害程序性加重，能较好地模拟人类脑血管病和痴呆状态，且在结扎术后2～3个月学习记忆能力仍无恢复趋势，这有利于药物疗效的动态观察[5]。优点是：手术简单、创伤小、重复性好、死亡率低，是研究人类痴呆的病理生理学和治疗药物的一个较好的模型。但是提供的是全脑不完全性缺血模型（慢性低灌注），对脑外的其他脏器也有影响，与人类脑梗死通常由单一脑动脉闭塞所导致的情形不同。

单纯结扎大鼠双侧CCA，由于大脑动脉环的代偿作用，侧支循环的建立，难以达到理想的全脑缺血状态，从而影响模型的可靠性。而复合模型的出现较好地解决了这些问题：①两动脉阻断与尾端放血法。分离双侧CCA并结扎，2次短时阻断血流，同时从尾尖部放血（不超过每100 g体重1 ml），然后使血流复通。②两动脉阻断与高脂血症。首先将实验大鼠用高脂饲料喂养1个月，待血脂升高后再用两动脉阻断法。缺血时阻断双侧CCA 3次，每次10 min，每次间隔10 min，通过阻断与开放双侧CCA，实现全脑缺血再灌流模型。③两动脉阻断与硝普钠降血压法。分离双侧CCA，穿线备用，腹腔注射硝普钠（205 mg/kg）造成低血压，立即夹闭双侧CCA 10 min，再通10 min，如此反复3次。

1.4 大脑中动脉栓塞 目前制备大脑中动脉栓塞模型的代表方法是Koizumi[13]和Longa[14]法。采用颈部正中切口，分离出CCA、颈外动脉（external carotid artery，ECA）和颈内动脉（internal carotid artery，ICA），将硅胶或多聚赖氨酸包被好的尼龙线由ECA（Longa方法）或CCA（Koizumi方法）经ICA小心插入颅内并越过大脑中动脉（middle cerebral artery，MCA），到达大脑前动脉起始部，阻断MCA血液供应制成MCA栓塞动物模型。这种模型缺血部位恒定，且可进行再灌注，模拟了人类永久性及短暂性局灶性脑缺血的不同状态。优点：缺血灶明确、可重复性强；模型动物存在明显的学习记忆障碍[15]。但手术操作需要技巧；脑栓塞与人群常见的脑梗死存在一定差异。

2 多发性脑梗死VD模型

采用颈动脉注射微小栓子方法制作多发性脑梗死VD（multiple cerebral infarct VD model）模型。参考Kaneko等[16]的方法加以改进，在生理盐水中加入同种大鼠血凝块制成的混悬液，从实验大鼠CCA推注栓子盐水混悬液，在注入栓子的同时开放CCA，利用CCA的血液栓子通过ICA送入颅内至鼠脑各动脉，造成多灶性脑梗死。已有研究显示多发性脑梗死模型动物具有明显的学习等认知功能障碍[17]。

许多化合物和人工栓子材料曾经被注射入大鼠CCA或ICA诱导脑栓塞缺血模型。其中，微球诱导的微栓塞研究得最为广泛[18-19]。微球注射导致持续性脑血流量减低[20]，诱导的缺血损伤的程度及严重性与栓子的数量相关，且病灶的发展缓慢，注射24 h后病灶仍在增加[18]。另外一个特征是病灶发展的多灶性及不均匀性[21]。

该模型的优点是：多灶和不均匀性使得该模型类似于临床上多发性脑梗死或腔隙性卒中[22]；缺血病灶的缓慢发展导致一个较长的治疗时间窗。缺点是：由于栓子的随机性，无法预测梗死的部位和大小，侧支循环的影响使组织缺血程度不一，不利于神经症状观察和组织定量分析；微球栓塞法中的栓子不能很好地模拟人类脑栓塞的栓子性质，该模型诱导的病灶不能准确地模拟临床状况，从而限制了它的应用，研究工作有待进一步的拓展。

此外，国内还有其他血管内栓塞VD造模方法，如左心室注射液体石蜡模型，舌下静脉注入铁粉模型线栓法等。

3 光诱导血栓形成VD模型

光化学法的基本原理是在全身注射光敏剂后，采用特定波长光源照射大脑皮层局部，通过化学反应导致局部血管内皮损伤、产生脑水肿和血小板微血栓，形成局灶性脑梗死。通过选择照射区域而确定皮层梗死灶位置。由于该模型具备实验动物创伤小，模型稳定性好且易于复制等优点得到了比较广泛的应用。动物存活率高，存活时间长，学习记忆障碍明显[23-24]。无论是从光化学法模型的原理，还是VD的发病原因和过程而言，该模型都适用于VD模型的制作。

该模型的优点是[25]：通过控制光源的强度、时间和药物用量来控制脑梗死的部位、范围和深度；无须开颅，动物模型的成功率高，存活时间长，适于慢性脑缺血低灌注导致的认知及行为学研究和抗血小板聚集、血栓形成及功能恢复药物筛选。缺点是：不能实施完全的再灌注；该方法本质上是终末动脉的血栓形成易引起明显的微血管损伤，造成动脉闭塞；内皮细胞损害、血脑屏障破坏、血管源性脑水肿均与人类的病理变化不同；光敏物质的导入对研究全身血液循环系统的变化掺入了复杂因素。

4 自发性VD模型

自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）和自发性高血压卒中倾向大鼠（SHR-stroke-prone，SHRSP）被认为是最好的原发性高血压和卒中动物模型[26-27]。大多数SHRSP模型动物在穿通支动脉处出现动脉缺血性坏死和形成微小动脉瘤，并由此形成多发性脑梗死，病理学检查发现这些动物有脑梗死灶存在，行为学检查发现认知功能障碍。神经生化研究显示SHRSP动物的海马和大脑皮层乙酰胆碱浓度显著性降低，其行为异常与海马乙酰胆碱含量水平明显相关[28]，提示存在胆碱能神经递质系统损害，支持VD的生化和病理变化。最近，在6个月SHR的大脑皮层亦发现神经元凋亡和坏死及胶质细胞增生，提示SHR具有增加VD的危险因素。因此，从老龄SHR和SHRSP中可以筛选出遗传易感性的VD模型动物[26，29]。但显而易见，使用该方法制备VD模型，大鼠来源有限，价格相应较昂贵，不适宜开展大规模的研究。另外，自发性VD大鼠的发病与临床VD患者在多危险因素共同作用下发病的情况有所不同，值得注意。

5 观察指标

5.1 行为学观察 大脑海马神经元和额叶皮层下白质损伤可能是VD的病理基础。学习记忆是大脑的高级认知功能，是构成智能的要素。各种VD动物模型最终的行为学表现均为学习和记忆功能受损，故常把学习记忆的改善作为评价VD模型智能提高的指标。常用的观察啮齿类动物认知行为的方法有[5，30]：一次性被动回避反射实验如跳台法、避暗法、穿梭箱法；空间分辨学习记忆实验如Y形水迷宫实验、Morris水迷宫实验、操作式条件反射等。

5.2 组织形态学观察 作为参与学习和记忆功能的重要结构，海马是对缺血、缺氧损伤最为敏感的区域，前脑反复缺血再灌注及慢性脑低灌注造成海马结构损伤可能是学习和记忆受损的原因[5，31-32]。海马是脑内参与学习记忆、记忆贮存功能的重要部分，因此研究中多以皮质及海马CA区的神经细胞的变性损伤及胶质细胞增生变化作为观察指标。

5.3 神经生化指标观察 越来越多的实验和临床证据表明，胆碱能系统的损害参与了VD的形成，包括脑脊液乙酰胆碱含量减少、脑中降低的胆碱乙酰转移酶活性[33]。海马胆碱能神经元的损伤可能是认知功能受损害的形态学基础[15，28，34]。胆碱乙酰转移酶是胆碱能神经元的特殊标志，其分布与乙酰胆碱的分布几乎平行，故常可作为研究胆碱能神经的标志[35]。

综上所述，近年对VD实验动物模型方法的研究和探讨取得了长足的进步，但仍存在着许多问题。缺血性脑血管病是VD的主要原因，因此既往许多学者曾采用各种脑缺血模型进行VD的机制研究。而慢性脑缺血对认知过程影响的研究对阐明VD的病理过程是十分重要与必要的。然而，VD导致的学习记忆功能丧失是一个极其复杂的病理生理过程，脑血管病和痴呆的关系仍是未解之谜。模拟人类缺血性脑血管病的发病过程，建立重复性好、生理指标控制严格、利于病理指标观察的标准化VD动物模型，是研究VD发生发展机制及防治措施，疗效评价的关键[4]。相信随着神经科学技术的发展及科研水平的不断提高，VD动物模型的制作将会取得更深层次的突破，必将对VD的临床及实验研究起到更大的推动作用。

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