光化学法大鼠脑梗死模型的研究进展

黄 硕,张海林,张树泉

光化学法大鼠脑梗死模型的研究进展

黄 硕1,张海林2,张树泉2

在脑梗死的实验研究中,理想的动物模型,对于研究脑梗死的发病机制及防治措施具有重要意义。目前,用于脑梗死实验研究的动物主要有鼠、兔、狗、猴等,其中由于大鼠在心脑血管病变方面与人类较为相似,加之品系多、成本低等优点,成为该领域的主要实验对象。随着研究的深入,已经形成了多种相对成熟的脑梗死造模方法,包括线栓法、开颅电凝法、微栓子栓塞法、光化学法等。自Watson等[1]1985年通过光化学法建立脑梗死大鼠模型以来,该造模方法由于与人类脑梗死发生机制较为相似,对实验动物创伤小,模型稳定性好等优点得到了比较广泛的应用。现综述光化学法制作大鼠脑梗死模型如下。

1 造模原理及实验材料的选择

1.1 造模原理 利用光敏物质在特定波长光作用下产生自由基物质,直接损伤血管内皮细胞,使其产生脂质过氧化物,血小板黏附于血管内皮,激活凝血过程,形成血栓,阻塞血管导致缺血性脑损伤,引起炎症及坏死。诱发血栓过程中所产生的血管活性物质及神经毒性物质可损害血脑屏障和脑细胞,这与人类脑梗死发生极为相似[2]。

1.2 光敏剂及光源的选择 四氯四碘荧光素,别名孟加拉玫瑰红,英文名称rose Bengal,分子量为1 017.6,最大吸收波长为548 nm,是迄今已知的最强的光敏染料。其照射光源主要有卤素灯加546 nm滤光片、氪激光器、氙灯辐照系统等[3,4]。有学者报道,手持式激光器(激光笔)价格低廉,其发出的激光波长为532 nm,可作为实验光源[5]。赤藓红B,英文名称erythrosin B,其最大吸收峰约在520 nm,大鼠最常用剂量(17～ 20)mg/kg,腹腔或静脉注射,其最常用的光源是波长514.5 nm的氩激光光源。照射时间一般为(2～5) min。光敏Ⅱ,英文名Photofrin II,是一种包括血卟啉醚等多种成分的混合物,其最大吸收峰位于(615～ 635)nm,配合波长632 nm红色激光照射,可产生含有大量红细胞和白细胞的血小板性血栓,与人类的脑血栓形成较为相似。

2 常用的大鼠光化学法脑梗死模型

自1985年Waston等成功建立大鼠光化学法脑梗死模型以来,此模型已经发展为4型:大脑皮质终末动脉阻塞模型、环形照射模型、大脑中动脉阻塞模型、颈总动脉阻塞模型。

2.1 大脑皮质终末动脉阻塞模型(Ⅰ型) 该模型是经典的光化学法诱导皮质局灶性脑缺血模型,基本步骤是:首先选定照射部位(一般选在皮质功能区或海马区),将充分暴露颅骨的大鼠固定在立体定位仪上,尾静脉或腹腔注射光敏剂,用相应光源进行照射,部位大小可以按照需要进行调整。该模型是早期即可出现血脑屏障开放、严重的血管源性脑水肿及微血管血栓形成,因此可用于脑梗死后微血管损伤及血脑屏障改变后的病理生理、生化及抗血小板药物防治作用的研究。但是此种方法造成的是皮质终末动脉的永久性闭塞,不利于对侧支循环建立及缺血再灌注损伤的研究,同时由于缺血半暗带范围很狭小且很快消失,亦不利于观察缺血半暗带的变化及相关药物的防治作用。由于该模型自发性高血压大鼠比正常大鼠产生的梗死范围大且稳定,因而选择自发性高血压大鼠造模更适合抗血栓药物的研究[6]。

2.2 环形照射模型(Ⅱ型) 此模型的建立方法与Ⅰ型模型基本相同,但该模型照射的光源为环形光斑,使照射皮质产生一个环形的缺血性损伤,中间的环形脑组织因不完全缺血产生一个类似半暗带的区域[7]。该模型主要用于观察缺血半暗带的病理变化及评价各种脑保护防治措施的效果。由于此模型在72 h后还存在自发性的再灌注,因此也可以用于对缺血再灌注损伤及其防治的研究。

2.3 大脑中动脉阻塞模型(即Ⅲ型) 1987年Watson等[8]首先制成光化学大鼠大脑中动脉(MCA)闭塞模型,之后许多学者对该模型进行了改进。基本步骤是经雄性W istar大鼠股静脉缓慢注入12.5 mg/kg血卟啉衍生物的同时,用波长630 nm 氮氖激光照射左侧MCA近侧段15 min,手术显微镜下观察白色血栓形成。然后夹闭双侧颈总动脉(CCA)1 h开放使其再通。该方法可使MCA被照射段形成闭塞性血小板血栓,使其供血区形成较大且稳定的梗死灶[9]。

2.4 颈总动脉阻塞模型(Ⅳ型) 该模型是一个多发性脑梗死模型,其基本方法为暴露颈总动脉并结扎同侧颈外动脉,注射光敏剂后将光源直射颈总动脉,同时不断轻微拨动颈总动脉,使产生的血栓栓子随血流入脑从而产生了多发的脑梗死灶。该方法模拟了人类栓子所致脑梗死,适用于多发性脑梗死及抗血小板集聚药物的研究。其缺点是所需光照强度和光敏剂剂量大,动物模型长期的死亡率较高,不利于慢性脑缺血研究。

目前在四种模型中,Ⅰ型和Ⅲ型应用较多。如谢志忠等[10]、张光运等[11]应用Ⅰ型模型分别研究了绞股蓝总皂苷对脑缺血损伤及环磷酰胺对脑组织缺血再灌注损伤的保护作用;崔建岭等[12]通过Ⅲ模型进行了静脉溶栓治疗的研究,而杨文清等[13]通过该模型观察了水蛭提取物对脑梗死的治疗作用。

3 检测指标

3.1 神经功能缺损评分 理想的评分标准应既可以综合反映神经功能评分,又有较好的可操作性和稳定性。目前在中风临床前药物研究中,Bederson评分[14]被国内外学者所公认,引用频率较高,简单介绍如下。该评分标准分为四个功能等级:A无神经损伤症状为0分;B悬尾实验不能完全伸展对侧前爪为1分;C前肢抵抗对侧推力能力下降为2分;D向对侧转圈为3分。一些学者在应用Bede rson评分同时,对其进行了改进,如Menzies评分[15]总分为4分:A,无神经功能损伤,双前肢对称向地面伸展(0分);B,对侧前肢持续内收(1分),C,对侧前肢握力下降(2分);D,轻微刺激大鼠尾巴,向对侧转圈(3分)或者自主持续转圈(4分)。

3.2 脑组织水肿程度的监测 目前评价脑组织水肿程度的方法主要是脑组织比重梯度柱测定[16]和脑组织含水量测定[17]。

3.3 脑梗死灶体积的测定 脑梗死灶的体积大小直接反映了脑缺血的严重程度及预后判断。目前较为常用的方法是将梗死侧的脑组织切片,经氯化四氮唑(TTC)染色,正常组织为红色,而梗死区为白色,采用图像采集处理系统软件测量梗死面积,计算梗死体积[18]。另外,有条件的科研机构,也可以直接行大鼠颅脑MR检查,在MR机上测量计算梗死灶体积。

3.4 其他 除上述常用指标外,还有一些用于研究药物作用机制或病理生理过程的指标。例如,凝血因子的监测、炎性因子(TNF-α、IL-6等)的测定、血管内皮因子及其基因表达的监测、神经生长因子的监测等。

4 问题与展望

光化学法大鼠脑梗死模型较好地模拟了人类的卒中发病机制,有很大的发展前景,但在很多方面仍需进一步完善。临床中脑梗死患者多合并有高血压病、糖尿病等疾病,并且这些疾病本身作为脑梗死的危险因素,参与了其发病过程,因此建立合并相关疾病的光化学大鼠脑梗死模型,更能接近临床实践,有必要开展此类模型的研究。目前的脑梗死模型均不能完全模拟人类卒中发病机制,有自身固有的优缺点,因此应根据研究目的选择不同的脑梗死模型才能保证研究的科学性。

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R743 R255

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.05.017

1672-1349(2015)05-0610-02

2014-07-29)

(本文编辑 王雅洁)

1山东中医药大学2012级硕士研究生(济南250000);2.泰安市中医医院

黄硕,E-mail:shixiaoyehs@163.com