潮汕沿海地区食管癌样本库的建立及其应用

林旋豪，王少洪，吴智勇，蓝斌，李帆，肖坤胜，许秀娥，吴健谊，傅俊惠，章克毅，姚晓冬，范扬航，郑海波，郑春鹏，李锐雄，黄建豪，张仕义，陈捷鑫，李卓毅，朱天翔，杨彦龙，张泽淳，杜泽森，黄崇植，林晓榕，许小超，赵麟，许丽艳，李恩民

·生物样本库建设·

潮汕沿海地区食管癌样本库的建立及其应用

林旋豪，王少洪，吴智勇，蓝斌，李帆，肖坤胜，许秀娥，吴健谊，傅俊惠，章克毅，姚晓冬，范扬航，郑海波，郑春鹏，李锐雄，黄建豪，张仕义，陈捷鑫，李卓毅，朱天翔，杨彦龙，张泽淳，杜泽森，黄崇植，林晓榕，许小超，赵麟，许丽艳，李恩民

食管癌（esophageal cancer，EC）是全球常见八大恶性肿瘤之一，位居恶性肿瘤死亡率第六位［1-2］。依据组织病理类型分类，食管癌主要包括食管鳞癌和食管腺癌。食管鳞癌主要集中在亚洲的中东部和非洲等地区，而食管腺癌则在欧美等国家地区多发［3］。我国是世界上最主要的食管鳞癌高发国，食管鳞癌病例占全部食管癌病例的 90% 以上，并呈现明显的地理性分布差异，主要分布在河北、河南和山西三省交界的太行山地区，闽粤交界的潮汕沿海地区，鄂皖交界的大别山地区，四川北部地区，新疆哈萨克族居民居住地区和苏北地区等［4-5］。肿瘤流行病学调查结果表明，潮汕地区是我国唯一的沿海食管癌高发区，与我国其他内陆型食管癌高发区相比，其地理位置与气候条件，以及当地居民饮食生活习俗等均明显不同。1995-2004年的流行病学调查结果显示，该地区食管癌的标化发病率为 74.47/105［6-7］。在潮汕当地，食管鳞癌的发病率一直高居各类恶性肿瘤之首。在此背景之下，毋庸置疑，建立潮汕沿海地区食管癌样本库是十分重要的工作，对揭示食管癌，尤其是食管鳞癌的病因，阐明这种特殊恶性肿瘤发病的分子机制，寻找其早期癌变特异性分子标志物，以利于早期发现、早期诊断和早期治疗，以及监测治疗后患者病情发展转归、预警预后等均有着十分重要的意义。

1 标本收集

由于食管癌发病症状比较晚，大部分患者就诊时已处于中晚期［8］，甚至部分患者就诊时就已经出现转移。建立潮汕沿海地区食管癌样本库的目的是采集、保存和利用好该特色疾病资源，满足医学科学研究的需要，同时以合作的方式为其他科研机构的研究者提供食管癌样本，共享疾病研究资源，促进相关科学研究。

首先，我们建立潮汕沿海地区食管癌样本库，是在国家863 重大专项基金的框架下实施的，其规则程序已经过汕头市中心医院伦理委员会审查，食管癌样本的收集过程接受汕头市中心医院伦理委员会监督。其次，在专业设计基础之上，我们制定出食管癌组织，配对的食管癌旁组织与食管癌手术远端切缘相对正常食管上皮组织，以及食管癌患者活检组织与血液标本的收集计划和使用规范。再次，上述所有生物标本的采集均签署《知情同意书》，在不额外增加患者痛苦和不影响临床病理诊断的原则下进行［9］。自 2007年11月，我们开始收集在汕头市中心医院肿瘤外科和心胸外科确诊的食管癌患者，手术切除的食管癌组织、癌旁组织和远端切缘相对正常食管上皮组织标本，以及食管癌患者活检组织，分别以液氮速冻和石蜡包埋的方式进行处理。同时配对收集患者术前和术后血液标本，分离血清、血浆和淋巴细胞，标本经液氮速冻后保存于 -80 ℃ 超低温冰箱。与此同时，通过生物样本库信息管理系统对上述各生物标本及其相关信息进行动态管理。

截至 2015年11月9日，本食管癌样本库已经收集石蜡组织标本 3264 例，冰冻组织标本 996 例，配套血液标本 835 例。

2 标本处理

在生物芯片上海国家工程研究中心的指导下，潮汕沿海地区食管癌样本库已经完成《汕头市中心医院——生物样本库规划建设方案》和《汕头市中心医院——生物样本库SOP》两份指南性文件［10-12］，制定了严格、规范的操作流程，并在操作过程中严格执行该标准化程序。本食管癌样本库工作人员均参加了中国医药生物技术协会组织生物样本库分会组织的样本库标准化培训，并获得上岗证书。所有取材人员都经过一年以上的病理取材培训，能够在确保取材部位准确性的前提下进行快速规范地取材［13］。

⑴冰冻组织：分别选取切缘相对正常食管上皮组织、癌旁组织和食管癌组织，切割成 0.5 cm3的小组织块装管。

⑵石蜡组织：组织经程序化固定、脱水和包埋后制作成石蜡块，常温保存。

⑶血液：非抗凝血和抗凝血各 1 管，5 ml，静置 30 min后在 4 ℃ 条件下，1200 × g 离心 10 min，分离其血清、血浆和淋巴细胞。血清和血浆在 4 ℃，1800 × g 条件下进行二次离心，离心 10 min 后分装，分装管数根据抽血量不同而各异，每管为 300 μl。

⑷速冻及保存：冰冻组织标本和血液标本分装标注后，经液氮速冻 60 s，然后转移到 -80 ℃ 超低温冰箱进行长期保存。

3 数据录入与随访

本库选用无锡市朗珈生物医学工程有限公司开发的生物样本库信息管理系统对入库标本进行智能化管理，主要包括标本信息、标本相关信息和应用信息等［14］。标本信息如标本编码、取材处理、储存记录及质量控制等信息；标本相关信息如患者临床信息和随访信息等；应用信息如食管癌样本使用者反馈的信息等。标本的编码和储存位置由管理软件分配生成，患者临床信息通过电子病历系统和病理质控与资料管理系统提取生成。手工录入的信息主要有生物标本的取材处理信息如分装管数、石蜡块数量和标本处理时间以及随访信息。潮汕沿海地区食管癌样本库有专职工作人员从事患者的随访和数据库更新，完善的随访信息有利于医院临床诊疗及医学科学研究的进行。临床医师通过随访信息获知治疗结果，为评估临床治疗方案提供相关标准，有助于诊疗方案的完善和改进；医学科学研究通过总生存期及无病生存期的分析作为研究课题是否具有临床意义的重要证据。

4 质量控制

随着功能基因组学和生物芯片技术研究的不断深入，生物样本的采集、储存成为转化医学研究的重要组成部分，组织的取材是否具有代表性、保存标本的质量如何等都是需要重点关注的问题，因此，建立质量管理体系是建设标准化、高质量生物样本库的重要环节［15］。基于标本编码，潮汕沿海地区食管癌样本库定期采用 Excel 软件生成随机数表的方式进行抽样检测，抽取石蜡组织标本进行 HE 染色，评估取材准确性和肿瘤细胞占比；定期检测食管鳞癌冰冻组织的 DNA、RNA 和蛋白质的完整性，比例约为 2%［16］。

⑴储存条件：本食管癌样本库配备了自动化温控监测系统，对室温、超低温冰箱和液氮罐进行 24 h 持续监控，监测频率为 30 min/次。

⑵肿瘤细胞比例：随机抽取标本，经切片、苏木素和伊红染色后在镜下评估肿瘤细胞的百分比，大于 80% 为良好，小于 65% 为不合格。

⑶核酸完整性：定期抽取标本，利用紫外分光光度计检测核酸的丰度和纯度，采用琼脂糖电泳测定组织样本的DNA 和 RNA 的完整性。

⑷蛋白质完整性：定期抽取标本，采用 Western blot 测定目标蛋白的完整性。

⑸信息准确度：对生物样本信息进行抽检，检查其完整性和准确性。主要是检查新入库样本的标本信息和患者临床信息是否完整，虚拟库与实体库的位置是否对应等。通过系统查询并打印存档来校对和控制相关信息的完整性。

本食管癌样本库储存的标本经组织学、分子生物学等质量控制技术检验显示符合研究要求，可以支持各相关科学研究。

5 应用

本潮汕沿海地区食管癌样本库是汕头市中心医院和汕头大学潮汕沿海地区高发肿瘤分子生物学广东省高校重点实验室（汕头大学医学院生化与分子生物学教研室）合作共建，主要为建库双方和其他合作单位提供资源进行相关科学研究，样本使用者必须具有一定的资质，能妥善利用样本资源。同时，要求使用者及时反馈样本使用情况，包括生物标本 DNA/RNA/蛋白质量等基本质量信息，也包括课题产生的部分特有实验数据，以利于生物样本库的改进和不断发展。

2007年以来，该特色生物样本库共支持各类科研项目累计 20 余项，主要包括国家 863 重大科研专项 3 项，NSFC-广东联合基金重点项目 2 项，国家自然科学基金面上项目 6 项，国家自然科学基金青年基金项目 6 项等，在Nature、Clin Cancer Res、J Pathology 等期刊杂志上发表 SCI收录研究论文 30 余篇，累计 SCI 影响因子大于 120。

6 小结

按照生物样本库建立规范标准，我们已成功建立了潮汕沿海地区食管癌样本库，而且利用该特色生物样本库促进相关科学研究成效显著。

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国家 863 重大专项（2012AA02A209、2012AA02A503）

515051 汕头市中心医院病理科（林旋豪、王少洪、李帆、肖坤胜），肿瘤外科（吴智勇、傅俊惠、章克毅、姚晓冬、范扬航、郑海波、郑春鹏、黄建豪、张仕义、陈捷鑫、李卓毅、张泽淳、杜泽森、黄崇植、林晓榕、许小超、赵麟），心胸外科（蓝斌、李锐雄、朱天翔、杨彦龙）；515041 汕头大学医学院生化与分子生物学教研室（许秀娥、吴健谊、李恩民），潮汕沿海地区高发肿瘤分子生物学广东省高校重点实验室（吴健谊、许丽艳、李恩民）

王少洪，Email：w196303@sohu.com；吴智勇，Email：stwuzy@163.com；蓝斌，Email：swatowdoctor@126.com

2015-11-19