骨髓干细胞对终末期肝病治疗的临床研究进展

郑林华 韩英

·综述·

骨髓干细胞对终末期肝病治疗的临床研究进展

郑林华 韩英

目前利用骨髓干细胞（BMSC）治疗终末期肝病越来越受到关注，且大多数研究表明BMSC能有效改善患者的肝功能，然而其具体机制尚不清楚。目前采集BMSC的方法有多种，比如可以采用粒细胞集落刺激因子（G-CSF）动员BMSC至外周血，然后通过外周血采集干细胞，或者直接从骨髓中采集干细胞。BMSC主要含骨髓造血干细胞（HSC）和间充质干细胞（MSC），哪种干细胞是促进肝功能恢复的主要细胞目前仍有争论。因此，本文将从临床研究总结BMSC在终末期肝病治疗中的研究进展。

肝病； 间质干细胞； 骨髓； 粒细胞集落刺激因子

终末期肝病是由各种慢性肝脏损害所导致的肝脏疾病晚期阶段。对于终末期肝病，内科常规的保肝和对症治疗并不能延长患者生存期，原位肝移植是唯一有效的治疗手段，但受供肝缺乏、费用高昂等因素的严重限制，目前急需寻找其他的治疗方法来治疗终末期肝病。近年来，陆续有一些研究报道利用干细胞可有效改善终末期肝病患者的肝功能［1-2］。而骨髓是成体干细胞的重要来源，即骨髓源干细胞（bone marrow-derived stem cell， BMSC），主要包含造血干细胞（hematopoietic stem cell， HSC）和间充质干细胞（mesenchymal stem cell， MSC）。本文将回顾相关研究探讨BMSC在治疗终末期肝病中的临床研究进展。

一、临床研究

1.粒细胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor， G-CSF）动员BMSC：研究已经证实，对于慢性肝病患者，采用G-CSF动员BMSC至外周血是安全和可行的。Gaia等［3］研究报道，8例肝硬化患者接受G-CSF（10 μg/（kg·d），连续3 d）动员BMSC至外周血，结果发现外周血中的CD34+细胞数目越多，肝功能恢复越明显，且研究并未发现明显的不良反应。另外一项随机对照研究报道，随机入组24例酒精性脂肪肝患者，患者接受G-CSF（10 μg/（kg·d），连续5 d）或安慰剂动员BMSC，结果发现，与对照组相比，G-CSF能增加患者血浆中肝细胞生长因子，且在7 d内能有效诱导肝祖细胞的增殖，然而患者肝功能却无明显恢复趋势［4］。一项对照双盲非随机研究中，47例慢加急性肝功能衰竭患者分别接受G-CSF（5 μg/kg，连续12疗程，皮下注射）或安慰剂，与安慰剂组相比，G-CSF明显提高患者2个月生存率，降低CTP评分和MELD评分，并降低并发脓毒血症、肝肾综合征和肝性脑病的发生率［5］。

虽然以上研究结果证明，采用G-CSF治疗终末期肝病是有效的，然而这些研究并未观察长期疗效。且大多数的研究设计为非对照研究，或者非双盲及非随机研究，病例数相对较少，故结果存在一定的局限性。这些研究中涉及的肝损害病因较多，而哪种病因的终末期肝病患者适合这种方法治疗目前尚不清楚。并且其治疗终末期肝病的机制也不完全清楚，肝功能的恢复是G-CSF对肝细胞的直接影响，亦或与外周血BMSC数量的增加相关尚需要进一步探讨。

2.G-CSF动员后采集外周血BMSC：Gordon等［6］研究者将5例病毒或酒精相关肝硬化患者接受G-CSF后，从外周血搜集CD34+干细胞，将这些干细胞在体外培养后，通过患者肝动脉进行自体干细胞移植。结果发现，外周血干细胞移植后能明显降低患者血浆胆红素、升高白蛋白水平。但他们的研究病例数较少，且缺乏对照，随访时间较短（仅2个月），因此研究结果存在一定的局限性。另一项研究同样采用G-CSF动员酒精性肝硬化患者BMSC至外周血后采集CD34+干细胞，将干细胞在体外培养7 d后通过患者肝动脉进行移植。随访90 d后，发现干细胞移植后能有效提升白蛋白水平，降低CTP评分，降低腹水的发生［7］，同样此研究也没有对照组。Salama等［8］研究选取48例终末期肝病患者（其中36例丙肝相关肝病，12例自身免疫性肝病），给予G-CSF后采集外周血CD34+干细胞，然后将CD34+干细胞进行扩增、培养，诱导其转分化为肝细胞，最后通过肝动脉或门静脉进行回输。他们将采用传统方案治疗的患者作为对照，结果发现，与对照组相比，干细胞治疗组显著提高患者的一年生存率。前期本课题组设计了随机对照临床研究，对仅接受G-CSF动员与G-CSF动员后采集外周血干细胞进行自体干细胞移植两种方法之间的安全性和有效性进行了比较。本研究选取40例乙肝相关失代偿期肝硬化随机分为2组，一组用G-CSF动员患者BMSC至外周血，再分离、采集干细胞（未进行体外培养），经肝动脉回输至患者肝脏，另一组仅接受G-CSF。随访结果表明，与G-CSF组相比，自体外周血干细胞治疗组患者肝功能显著恢复，主要表现为患者外周血白蛋白、胆碱酯酶、胆固醇和凝血酶原活动度等肝脏合成指标的明显改善［9］。到目前为止，已对近400例乙肝相关失代偿期肝硬化患者进行了自体外周血干细胞移植治疗，随访时间为1 ～ 5.5年，回顾性的病例对照分析显示，自体外周血干细胞移植可显著提高患者的3年生存率和5年生存率。然而最近一项随机、对照、开放研究，对58例酒精性肝硬化失代偿期患者进行G-CSF动员后搜集外周血干细胞通过肝动脉进行移植，与仅接受传统治疗方案的患者相比，两组患者肝功能均有轻微的改善，并无统计学意义［10］。

3.骨髓HSC：Terai等［11］研究了9例接受自体骨髓HSC治疗的肝硬化患者，在6个月的随访中所有患者未发生肝细胞癌，且干细胞移植后有效的改善了患者白蛋白和总蛋白水平，以及CTP评分。同样，Kim等［12］对10例乙肝相关失代偿期肝硬化患者进行自体骨髓HSC移植后，结果发现干细胞移植后改善了患者白蛋白水平、CTP评分、肝脏体积和腹水发生。通过肝脏组织切片发现，干细胞移植后肝内祖细胞开始逐渐活化，在第3个月时达到高峰，提示肝祖细胞的活化是促进肝功能恢复的主要机制。然而他们发现HSC并不能改善肝纤维化，也未发现肝星形细胞的活化。以上研究均为非对照、非双盲的小样本研究。Lyra等［13］设计了一项对照非双盲非随机临床研究，他们将等待接受原位肝移植的30例患者，分为2组：15例接受自体骨髓HSC移植，15例未接受干细胞移植，结果发现，在随访第90天，接受HSC移植的患者血浆白蛋白水平和CTP评分得到明显的改善。最近一项研究中，选取11例肝癌患者，在其接受门静脉栓塞术和右肝叶切除术之前接受CD133+骨髓细胞移植术，评估干细胞移植的安全性和有效性，结果发现与对照组相比，接受HSC移植后患者在术后其肝脏再生明显较快［14-15］。但由于本研究为回顾性、非双盲、非随机研究，因此其结论需要进一步验证。

4.BMSC：Mohamadnejad等［16］最早报道应用自体BMSC移植治疗终末期肝病，直接从骨髓中获取骨髓单个核细胞后，体外诱导成MSC，经外周静脉回输至患者体内，经过12个月的随访，该方法安全且无不良反应发生，随访中发现患者症状明显改善，血浆白蛋白升高，腹水减少，肝体积增大，MELD评分降低。近年来，有研究采用BMSC体外诱导成肝细胞样细胞后进行自体回输治疗丙肝相关的终末期肝病，结果发现患者腹水减少，白蛋白水平明显升高，CTP和MELD评分降低［17］。国内学者应用自体骨髓MSC治疗乙肝相关肝衰竭患者，结果发现4周内患者白蛋白、凝血酶时间原活动度、总胆红素及MELD评分明显改善，但长期随访疗效并不明显［18］。一项研究对15例丙肝相关的肝硬化患者通过静脉注射进行BMSC移植，结果表明与对照组相比MSC移植后能部分促进患者肝功能恢复［19］。另一项研究中，5例乙肝相关肝硬化患者接受了CD34-CD44+和CD44+CD45-的骨髓源MSC细胞移植，105例年龄、性别和肝功能生化指标相匹配的患者作为对照，研究结果表明与对照组相比，接受干细胞移植后2 ～ 3周内患者的肝功能和MELD评分明显改善，而4年生存率和原发性肝癌的发生率无明显差异［18］。

二、BMSC治疗终末期肝病的可能机制

目前，虽然越来越多的研究表明自体BMSC能有效地改善终末期肝病患者的肝功能，然而有关BMSC促进肝功能恢复的机理尚不清楚。总结相关研究，主要分为以下几种观点：

1.融合和转分化作用：早期的研究证明，干细胞可能通过细胞融合和转分化为肝细胞发挥治疗肝硬化的作用［20］。以Fah基因作为供体细胞的追踪标志，将Fah+/+ BMSC移植给肝损伤的Fah-/-小鼠，受体小鼠新生成的肝细胞同时表达供体鼠和受体鼠的基因，提示BMSC可与内源性肝细胞融合并促进肝细胞功能［21］。Malcolm等［22］报道显示，成人骨髓源或外周血中的干细胞可以转分化为肝细胞样细胞来代替损伤的肝细胞发挥功能。也有研究表明，BMSC是肝内肝细胞（卵圆细胞）的来源细胞，在大鼠肝损伤模型中，移植的BMSC具有卵圆细胞的表面标志分子（OV-6、甲胎蛋白等），同时也表达BMSC的标志分子（Thy-1、CD34、c-kit），提示干细胞可以转分化为肝脏干细胞，进而向肝细胞、胆管上皮细胞等分化［23］。本课题组前期同样证实：来自失代偿期肝硬化患者的外周血干细胞在体外可被诱导而转分化为肝细胞样细胞［24］；示踪移植入裸鼠体内的人外周血干细胞，发现其可定植于裸鼠肝脏［25］；CD14+的单个核细胞移植可减轻肝硬化大鼠的肝脏纤维化程度、改善其肝功能［26］。

2.旁分泌和免疫调节作用：目前越来越多的研究发现BMSC通过旁分泌的作用支持肝细胞的功能和肝脏再生。一些研究表明，肝脏损伤后通过分泌肝细胞生长因子、G-CSF等动员BMSC向损伤的肝脏转移，促进细胞外基质的降解及抗炎反应，从而维持肝内微环境的稳定，支持肝细胞的功能和肝脏再生［27-29］。另外，研究发现，BMSC通过分泌细胞因子和生长因子激活肝祖细胞，促进成熟肝细胞的增殖［30-31］。已经证实MSC可以分泌多种细胞因子，抑制炎细胞增殖及炎性细胞因子分泌，调节肝脏及全身免疫炎症反应，从而减轻肝脏的急性损伤，提高生存率［32-33］。BMSC移植后通过调节枯否氏细胞促进肝功能恢复，主要表现为促进肝内巨噬细胞（即枯否氏细胞）由M1型向M2型转移［34］。前期本课题组对42例接受干细胞移植治疗的患者进行了免疫相关指标的检测，结果发现：在干细胞治疗后患者外周血IL-17水平呈持续下降趋势，并与患者肝功能指标的变化呈正相关，进而通过动物实验验证BMSC通过下调IL-17水平促进肝功能恢复［35］。

三、存在的问题

近年来，BMSC在治疗终末期肝病中的临床和基础研究越来越多，虽然大多数的研究结果表明BMSC能有效改善患者肝功能，然而这些研究仍处于早期阶段，且研究设计或多或少存在一定的缺陷。一期临床研究表明短期随访提示骨髓HSC和MSC是安全的，初步的数据证实对急性肝病患者更能取得临床疗效，但其疗效是短期的［36］。目前关于BMSC治疗终末期肝病的临床研究在病例的选取、采用G-CSF、干细胞的采集和处理、移植途径、疗效的评估等方面并没有统一的标准，哪种干细胞（骨髓源或外周血源、HSC或MSC）最好尚不清楚。临床研究中选取的肝损害病因多种多样，包括乙肝、丙肝、自身免疫性肝病、酒精性、隐源性等引起的终末期肝病，这样会影响研究者对临床疗效的评估。因此在未来的临床研究中集中在一种或少量几种肝损害病因是非常必要的。

临床研究中关于BMSC的采集方法是另一个关键问题。有些研究将干细胞采集后在体外培养，并将干细胞诱导分化为肝细胞样细胞，由于体外培养干细胞使用的动物血清能诱发受体产生免疫反应，同样能影响临床结果。另外关于移植BMSC的数目在不同研究中并不统一，从一百万到及几十亿不等，其势必影响研究结果。但是目前尚无关于干细胞数目与疗效相关性的临床研究报道。

在不同的临床研究中，BMSC回输的途径也不统一。大多数研究选择经门静脉途径回输，然而这种方法可能会引起一过性的门静脉高压，从而限制干细胞在肝内的定植。也有研究采用肝动脉或外周静脉回输，目前尚无关于不同途径回输之间的安全性和有效性比较。一项动物研究发现，对急性爆发性肝炎动物模型，只有通过门静脉回输才能增加动物的存活率［37］。因此，关于哪种途径回输BMSC疗效较好、风险较低仍需要进一步研究探讨。

目前，关于BMSC回输后临床疗效的评估尚无明确指标。大多数研究采用肝功能生化指标，如胆红素、白蛋白、凝血酶原时间，也有采用腹水、CTP和MELD评分，少见的也有肝脏组织、肝脏体积指标等。然而采用生存率作为评估标准的研究较少，而上述这些指标并不能有效的代表生存率。可能由于目前大多数临床研究样本数较少，且随访时间较短，评估生存率存在一定的限制。

五、前景及挑战

基于BMSC具有自我更新及多向分化潜能的特性，将其应用于治疗终末期肝病的临床研究已经取得了令人鼓舞的进展。分子基因学和新型动物模型的研究表明BMSC与肝脏之间存在复杂的关系，然而在进行大型临床研究之前仍有许多问题需要解决。比如，尽管体外研究表明BMSC能向肝细胞转分化，然而临床研究中，BMSC是否转分化为有功能的肝细胞并不清楚。因此，目前关于BMSC促进肝功能恢复的具体机制仍需要深入研究和探讨。

BMSC治疗终末期肝病的目标是提高肝脏的再生能力以及促进纤维化基质的降解。然而如果肝脏内细胞外基质的正常结构受到破坏，BMSC移植的成功率可能大大降低，因为干细胞在肝内的定植可能受到限制。BMSC是否具有长期的复制潜能尚不清楚，在临床研究中还应考虑干细胞瘤变的可能性。如果临床研究中采用体外培养、且向肝细胞诱导分化的BMSC，那么应该建立一个统一的、有效的培养体系以降低培养体系对受体的影响。

在基础研究中必须全面了解BMSC的生物学特征，才能在临床中更好的应用BMSC治疗终末期肝病。总之，BMSC有可能成为治疗终末期肝病的有效治疗手段，从而给终末期肝病的患者带来新的希望。

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Clinical use of bone-marrow stem cell therapy for end-stage liver disease

Zheng Linhua,Han Ying. Xijing Hospital of Digestive Diseases, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China

Han Ying, Email:hanying@fmmu.edu.cn

At present， the use of bone marrow-derived stem cell （BMSC） in the treatment of end-stage liver disease has received more and more attention. And most of the researches suggest that BMSC could improve liver function of the patients with end-stage liver disease. However， the underlining mechanisms are still unknown. There are several methods to collect BMSC， for example， BMSC could be mobilized by granulocyte-colony stimulating factor（G-CSF） into the peripheral blood and subsequent collected through the peripheral blood. Or we can collect BMSC direct through bone marrow. BMSC include mainly hematopoietic stem cells（HSC） and mesenchymal stem cells （MSC）. But there is much debate concerning which kind of stem cells contributes more to hepatic improvement. Thus， this review will summarize the clinical research progress of BMSC in the treatment of end-stage liver diseases.

Liver diseases； mesenchymal stem cell； bone marrow； endstage liver diseases； granulocyte-colony stimulating factor

2014-09-16）

（本文编辑：蔡晓珍）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2015.02.011

710032 西安，第四军医大学西京消化病医院

韩英，Email：hanying@fmmu.edu.cn