结核感染T细胞斑点试验的临床应用价值

刘　丽　刘晓民

结核感染T细胞斑点试验的临床应用价值

刘丽刘晓民

【关键词】结核感染T细胞斑点试验;结核;敏感性;特异性

在世界范围内结核病是一种高发病率、高病死率的疾病，因此研究出一种新的检查手段已迫在眉睫。结核感染T细胞斑点试验(T cells spot test of tuberculosis infection, T-SPOT.TB)，是利用酶联免疫斑点法检测结核感染者体内的特异性T淋巴细胞来诊断结核的一种新方法，具有较高的敏感性及特异性，目前已在临床上广泛应用[1]。

一、T-SOPT.TB方法诊断结核感染的优点

摘要根据2013年世界卫生组织发布的《2013年全球结核病报告执行》显示：2012年，据估算，全世界共有860万人罹患结核病，130万人死于结核病(其中包括32万艾滋病毒阳性者)，因此结核病的诊断与治疗是人类健康问题的焦点。传统的结核检查方法有胸部X线或肺纵隔CT，结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test ,TST)、痰抗酸杆菌涂片。胸部X线或肺纵隔CT实验方法缺乏特异性，且绝大多数患者胸部X线表现不典型，故只能作为结核病诊断的参考。TST操作简单、价格低廉，常用于临床，但易受免疫状况、交叉反应及接种卡介苗的影响，故敏感性及特异性较低。痰抗酸杆菌涂片临床上常用于肺结核的诊断，其受制于痰液中分枝杆菌数量，故敏感性较低，且无法对肺外结核及不咯痰的肺结核作出诊断，也使其应用受到一定的制约[2]。T-SPOT.TB 试剂盒是由Oxford Immunotec公司研制，用酶联免疫斑点技术检测对早期分泌抗原靶 6KD(early secretory antigenic target-6, ESAT-6)和培养滤液蛋白10KD(culture filtrate protein-10, CFP-10)有反应的T细胞，达到诊断结核感染。该方法具有较高的敏感性及特异性。

二、T-SOPT.TB的原理及结果判断

T-SPOT.TB 试剂盒2004年于欧洲上市，2008年，美国FDA完成对T-SPOT.TB的审批。2010年获得我国 SFDA 审批。与QFT实验不同，本实验必须隔离外周血单个核细胞(peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC)，而且为了保证实验的严谨，在收集血液样本后8 h内，必须隔离这些细胞。T-SPOT.TB是利用酶联免疫斑点法检测结核感染者体内的特异性T淋巴细胞来诊断结核的一种新方法，该方法源于Mahairas等在1996年发现的一段存在于致病性结核分枝杆菌中名为“RD1”的基因序列。该致病性结核菌所特有的基因片段即(RD1序列)仅在极少数的非结核杆菌内发现，该段基因编码表达的蛋白(ESAT-6蛋白质和CFP-10蛋白质)为致病性结核杆菌所特有，BCG(卡介苗)中没有发现存在此段基因。因此，曾经接种BCG的人不会因此发生免疫交叉反应而干扰实验结果。RD1编码产生的ESAT-6蛋白质和CFP-10蛋白质(culturefiltrate protein)作为特异性抗原刺激机体T淋巴细胞产生特异性的细胞因子γ干扰素(interferon-γ, IFN-γ)。机体受到致病性结核杆菌感染后，引发固有免疫和获得性免疫。由于机体内长期存在特异性的中央型以及效应型记忆细胞，当实验中加入的抗原(ESAT-6蛋白质和CFP-10蛋白质)再次刺激机体的T淋巴细胞时，这些记忆性T淋巴细胞可迅速活化增殖，并释放γ干扰素。通过酶联免疫斑点技术对γ干扰素的含量进行检测从而对致病性结核杆菌的感染进行诊断。酶联免疫斑点法检测特异性T淋巴细胞筛查结核患者现已应用于欧美各国临床结核诊断中，而在国内仅处于试验性诊断阶段。酶联免疫斑点技术能够检测出1/100 000至1/50 000的PBMC中经抗原刺激后释放细胞因子的细胞，目前已成为最敏感的检测方法之一。

T-SOPT.TB的实验结果清晰, 易于判断。当测试孔A或B达到以下标准则判定为阳性结果:①阴性对照斑点数为0-5个,(A或B孔斑点数-阴性孔斑点数)≥6,判断为阳性(+);②阴性对照斑点数≥6,A或B孔斑点数≥2倍阴性孔,判断为阳性(+);若A、B孔斑点数不够以上标准,且阳性对照反应良好,则为阴性(-)。若阴性对照孔斑点数超过10,阳性对照孔斑点数低于20时,结果不能确定。

三、T-SOPT.TB在结核病诊断中的应用价值

T-SOPT.TB在肺结核及肺外结核的诊断中都具有较高的敏感性及特异性。2005年Meier等[3]通过研究89例患者(其中65例被证实为肺结核，7例被证实肺外结核，5例非结核分支杆菌感染，12例非分支杆菌引起的肺部疾病)，72例结核病患者中(肺结核65例，肺外结核7例)，有70例患者T-SPOT.TB阳性，T-SPOT.TB的敏感性为97.2%。2010年 You等[4]对138例痰抗酸杆菌涂片阳性的患者中的63例行T-SPOT.TB检查，其中有56例患者T-SPOT.TB阳性，证实T-SPOT.TB的敏感性为88.9%。 2011年 Wu 等[5]对31例结核和32例非结核的患者分别进行自制的ELISPOT和T-SPOT.TB对比分析，T-SPOT.TB的敏感性为77.4%，特异性为78.1%。 2011年Cruz等[6]通过对210例患者(其中13例儿童证实为结核病)研究证实T-SPOT.TB的敏感性为92%。2012年Turtle等[7]通过对64例患者研究证实T-SPOT.TB的敏感性为83.3%，特异性为75%。 2014年 Zhu等[8]通过对413例患者(其中包括163例肺结核，39例肺外结核，106例非结核分枝杆菌感染的患者，105例健康对照组)的分析，证实T-SPOT.TB的敏感性为85.64%，特异性为91.76%。2014年Kim等[9]通过对196例患者(41例患者为肺结核，93例非结核分枝杆菌感染的患者，62例健康人)的分析。41例肺结核患者中有36例患者T-SPOT.TB呈阳性，T-SPOT.TB的敏感性为87.8%，93例非结核分枝杆菌感染的患者中，41例患者T-SPOT.TB阴性，T-SPOT.TB的特异性为44.1%。健康人中有47例T-SPOT.TB阴性，T-SPOT.TB的特异性为75.8%。2014年Liu等[10]通过对1 084例患者分析(其中包括结核病384例，健康对照组700例)，384例患者中有331例T-SPOT.TB阳性，T-SPOT.TB的敏感性为86.2%(331/384)，700例健康对照组中638例T-SPOT.TB阴性，特异性为91.1%(638/700)。

四、T-SOPT.TB在特殊人群中的应用价值

T-SOPT.TB在HIV患者的诊断中仍然具有较高的敏感性和特异性。2013年Yu[11]等通过对131例HIV患者研究证实T-SPOT.TB的敏感性为41.3%，特异性为94.6%。而TST的敏感性为12.9% ，特异性为91.8%。T-SOPT.TB在HIV患者中结核病的诊断率明显优于TST。T-SPOT.TB在免疫功能低下的患者中同样具有很高的敏感性和特异性。2012年Junq[12]等通过对119例痰涂阴免疫力低下的肺结核患者分别进行TST、QFT-GIT、T-SPOT.TB检测，TST的敏感性、特异性分别为41.2%，91.8%。QFT-GIT的敏感性、特异性分别为59%，61.3%。T-SPOT.TB的敏感性、特异性分别为72%，42.3%。2011年祁燕伟等[13]通过对81例HIV/AIDS患者合并肺结核的患者进行研究证实T-SPOT.TB的敏感性为79.01%，痰涂片的敏感性为49.38%。

五、T-SOPT.TB准确性的影响因素

Lee等[14]通过对 32例ITR患者(空白对照孔斑点超过10个，阳性质斑点数少于20个)的研究证实：T-SPOT.TB结果的准确性与患者年龄，基础疾病，应用免疫抑制剂治疗，淋巴细胞减少症无关。Lee等[15]通过研究324例患者得出结论：T-SPOT.TB的假阴性率为17%，TST的假阴性率为54%。与TST相比，T-SPOT.TB不易产生假阴性结果。且临床表现和免疫抑制对T-SPOT.TB的影响较小。Kim等[9]对196例患者T-SPOT.TB的假阳性多种因素分析得出结论：有结核感染病史的患者，X线上可见陈旧的结核纤维化疤痕的患者，年龄大的患者都会对T-SPOT.TB的结果产生干扰。T-SPOT.TB可以在未受污染的血液样本里进行，使用T-Cell Xtend 试剂储存过夜的血液样本不影响T细胞试剂灵敏度的测定。<25 ℃储存和运输是绝对必要条件，而且，对于污染的红细胞血样，使用细胞自动计数器可以减少敏感性的降低[16]。

T-SOPT.TB具有较高的敏感性及特异性，对肺结核及肺外结核都具有一定的诊断价值。且不受年龄、基础疾病、免疫缺陷的影响，能早期诊断结核感染，所需时间较短。但其不是确诊和排除结核的“金标准”，且对陈旧性结核及活动性结核的诊断缺乏特异性，价格昂贵。作为临床医生，需具体分析患者的综合情况，正确理解T-SOPT.TB，为临床结核病的诊断和鉴别诊断提供帮助。开发出一项新的检查方法能够鉴别陈旧性结核病及活动性结核病已成为防治TB的新目标。

参考文献

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16Talbot EA, Maro I, Ferguson K, et al. Maintenance of Sensitivity of the T-SPOT.TB Assay after Overnight Storage of Blood Samples, Dar es Salaam, Tanzania[J]. Tuberc Res Treat, 2012, 2012： 345290.

(本文编辑：黄红稷)

刘丽，刘晓民. 结核感染T细胞斑点试验的临床应用价值[J/CD]. 中华肺部疾病杂志： 电子版， 2015， 8(3)： 388-389.

·综述·

收稿日期：(2014-09-16)

文献标识码：中图法分类号： R52 A

通讯作者：刘晓民，Email: neikexue@126.com

DOI：作者单位： 150000 哈尔滨医科大学附属第一医院呼吸内科