WHO 2014年版《耐药结核病规划管理指南伙伴手册》解读之五(耐药结核病实验室检测)

王伟 刘京铭 李传友



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WHO 2014年版《耐药结核病规划管理指南伙伴手册》解读之五(耐药结核病实验室检测)

王伟 刘京铭 李传友

结核病实验室检测是确诊结核病，尤其是耐药结核病的重要依据，标准化操作是保证实验室质量的重要前提。耐药结核病的确诊需要检测到结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis, Mtb)并且进行药物敏感性试验(drug susceptibility testing，DST)，通过培养分离细菌菌株鉴定种属，采用液体或固体培养进行DST，或采用WHO认可的分子检测Mtb DNA和耐药突变来实现[1]。早期耐药检测对治疗方案的制定和控制结核病流行非常重要。由于传统耐药结核病诊断周期过长，延误有效的治疗方案制定，增加了耐药结核病传播概率，甚至在诊断期间患者体内出现新的耐药菌株，易导致根据DST 结果制定的治疗方案失败。因此，仅准确诊断仍然不能有效服务于耐药结核病控制，只有早期且准确地进行耐药结核病实验室诊断才是解决问题的关键。

WHO 2014 年版《耐药结核病规划管理指南伙伴手册》(简称“《手册》”)[2]中突出了耐药结核病实验室早期准确诊断的重要性，并用专门有独立的章节对这部分内容进行了阐述，从基本概念、实验室设置、实验室网络的组织、临床样本转运、实验室检测技术、DST 的合理使用、检测报告时间与周期、实验室生物安全和质量控制等方面做了全面而详细的论述。考虑到任何指南的实施均需与应用指南的国家或地区的实际情况相结合，指南中并非所有内容均适合各地实际情况，因此笔者对耐药结核病相关概念和实验室技术等部分进行了重点介绍和解读，对其他部分仅进行简要的介绍；希望对手册中的本部分内容的解读是一个有机整体又重点突出。

基本概念

《手册》[2]在实验室工作的这一章节与《耐药结核病规划管理指南(2008紧急更新版)》[3]相比，对实验室检测及DST的基本定义进行了部分更新和重新阐述，剔除了最低抑菌浓度的概念，增加了表型DST(phenotypic DST)、基因型DST(genotypic DST, 即分子药敏试验，molecular DST)、直接检测(direct testing)和间接检测(indirect testing)及有效性(validity)等概念[1]。与文献[3]基本保持了一致的概念包括临界药物浓度(critical drug concentration)重复性(reproduci-bility)，可靠性(reliability)和交叉耐药(cross resistance)。

一、重复性

指在独立的条件下试验或检测能被精确地重复或复制的能力。重复性与不同实验室、不同技术员或专家重复进行该试验的结果一致性相关。

二、可靠性

在相同条件下重复试验时，其结果一致性的程度。可靠性并不意味着正确性。一个可靠的试验可产生一致性的结果但不一定是正确的。例如，即使一个试验有很好的可靠性，但未必能给予临床正确的指导。

三、交叉耐药

对某一种抗结核药物产生耐药突变，可能也对该类药物中其他或全部的药物产生耐药。对不同种类药物的耐药则少见。

四、临界药物浓度

这一概念有了较之前更具体的阐述，可抑制95%的分离自患者且从未经治疗或暴露于该药物的结核分枝杆菌(假设为敏感菌株)，但此药物浓度不能抑制分离自该药物治疗无效患者的菌株(假设为耐药株)。类似乙胺丁醇的药物，没有合适的药物浓度符合该定义。对于此类药物，用于表型DST的临界药物浓度，不能很好地区分敏感株与耐药株。

五、表型DST

在某种抗结核药物存在的情况下，能否检测到分离株的生长或代谢的活性。

六、基因型DST

基因型检测结核分枝杆菌基因组中与特定耐药相关的突变；与此同时基因型检测还可通过检测结核分枝杆菌特定序列的存在情况以用于菌种鉴定。

七、直接检测

直接对临床样本(通常指痰标本)进行检测，将加工处理过的临床样本直接接种到含药或无药的培养基上，或者经处理后直接用于分子检测。

八、间接检测

基于对培养后的结核分枝杆菌进行检测[4]。

九、有效性

某项检测的有效性是指是否检测了应当检测的内容。理想情况下，DST检测结果应当可以预测临床疗效。

实验室检测技术

《手册》[2]在这部分依次介绍了涂片镜检、Xpert Mtb/RIF和线性探针检测(line probe assays, LPAs)两项分子检测技术，以及培养及菌种鉴定、DST等实验室检测方法。涂片镜检技术提到了引入发光二极管(LED)荧光显微镜技术后，较传统涂片镜检敏感度更高，还可大大节约检测时间。分子检测技术Xpert Mtb/RIF和LPAs技术是对文献[3]内容的更新和修订。此外，《手册》[2]在这一部分对DST的局限性和交叉耐药问题也做出了一定的解释和说明。

一、涂片镜检

《手册》[2]指出，WHO推荐引入LED荧光显微镜技术，该项技术的引入可以在不增加总测试成本的基础上提高检测敏感度，同时也大大节省了检测时间。涂片抗酸染色镜检无法区分活菌与死菌，也无法区分敏感与耐药，更无法鉴定种属，对耐药结核病疗效进行监测的价值有限。耐药结核病涂片镜检的目的主要限于评估初始细菌载量。当抗酸染色镜检阳性而培养阴性时，说明细菌可能为死菌，但并不能排除这类患者的传染性。当抗酸染色镜检呈阳性，分子检测结果阴性则应考虑可能是非结核分枝杆菌(NTM)感染。当前我国分子诊断产品多样，如PCR-荧光探针、多重PCR等技术均可较好地区分结核分枝杆菌与NTM，条件允许的情况下可适当应用上述技术，以避免误诊[5-6]。

二、Xpert Mtb/RIF

WHO在《手册》[2]中提出，患者有耐药结核病风险时，建议优先使用Xpert Mtb/RIF®作为初始诊断工具，而非涂片镜检、培养和表型DST。该技术在2010年得到了WHO的认可，目前是全球范围内被大力推广的结核病包括耐药结核病诊断技术之一。该技术的主要优越性在于其敏感度、特异度及准确度与固体培养相似，但其耗时非常短，可在2 h内完成测试并报告结果，可同时对结核分枝杆菌复合群进行DNA鉴定及利福平耐药相关基因突变的检测。因此，WHO推荐该技术作为MDR-TB高危人群的初选诊断方法。2013年底颁布了政策更新，指出该试剂盒应优先于传统涂片镜检、培养和DST作为成人和儿童疑似MDR-TB或HIV共感染TB的初选诊断方法。该技术可作为成人及儿童MDR-TB和HIV低风险人群镜检后的补充检测手段，尤其当痰涂片结果为阴性时。该技术可替代传统镜检和培养作为初选诊断方法应用于所有疑似结核的成年患者[7-8]。

三、LPAs技术

这项技术于2008年得到WHO的推荐，用于快速检测单独利福平或利福平合并异烟肼耐药。LPAs技术有高通量的特点，每天可以完成几个批次的检测。《手册》[2]提到，LPAs适用于中央或者国家参比实验室，地区级实验室要确保有适当基础设施(需要3个独立的房间)的条件下，也可以承担该项检测。该技术在实际应用中也存在一定的局限性，如检测结果需人工判读，有可能导致不同实验室之间，甚至同一实验室不同操作人员的报告结果不一致，操作流程较复杂，很难标准化；其次，该技术仅限于检测已知的结核分枝杆菌耐药突变位点；另外，目前可用的LPAs只适用于抗酸染色阳性的痰样本或者常规培养得到的结核分枝杆菌分离株。

四、结核分枝杆菌培养

较文献[3]不同的是，WHO在《手册》[2]中明确指出液体培养基是当前结核病细菌学确诊的参考方法。同时提出，高质量的标本、及时的运输，以及有质量保证的实验室对于提高培养检出率十分必要。两个版本都强调了人为操作原因导致错误的检查结果，诸如贴错标签或气溶胶产生过程中导致标本之间的交叉污染等，均可导致假阴性或者假阳性结果。因此，实验室报告的结果应结合患者临床情况，必要时要重复进行相关检测。

液体培养较固体培养结核分枝杆菌的复苏率高且耗时短，液体培养是一个更加灵敏的培养系统，其污染率较固体培养方法高。与固体培养相比，NTM分离株在液体培养基出现频率更高，因此，进行菌种鉴定加以区分是十分必要的。

五、结核分枝杆菌菌种鉴定

在结核病高负担国家，大多数分枝杆菌分离株均为结核分枝杆菌。《手册》[2]指出，在不同的国家和地区，NTM的流行程度不同，某些地区可能高于HIV感染人群。因此，必须对所有分离自液体或者固体培养基的菌株进行菌种鉴定，以区分NTM和结核分枝杆菌。菌种鉴定的方法多样，如表型检测(最常见的如硝酸还原试验、烟酸试验)，免疫层析，基因分型等。

《手册》[2]也指出临床医生必须意识到，基因型分析较表型检测更能快速地提供可靠的菌种鉴定结果，除非确定为结核分枝杆菌属，否则分枝杆菌的分离株对一线药物的耐药表型可能预示是NTM感染而并不一定是耐药结核病。

六、DST的作用及WHO推荐技术

DST对于耐药结核病患者及时发现和治疗，以及耐药结核病高危人群的筛查工作具有重要作用。《手册》[2]提出国家结核病防治规划应该有能力对任何疑似的耐药结核病患者提供DST服务。随着分子生物学技术的迅猛发展，耐药分子检测手段开始崭露头角。在基因型DST中，LPAs和Xpert Mtb/RIF是当前被WHO认可的仅有的2项用于利福平耐药的检测技术。例如，Xpert Mtb/RIF在利福平耐药及MDR-TB筛查工作中的突出优势，使其被WHO誉为结核病诊断中的革命性突破，得以在世界范围内被大力推广[9]。大多数情况下，尤其是使用一线抗结核药物固定剂量复合制剂(FDC)时，利福平耐药几乎都合并异烟肼耐药，检测到利福平耐药也意味着极有可能(但并非全部)是MDR-TB。快速利福平耐药检测的优势包括MDR-TB高风险患者的快速筛查，尽早发现不适当的一线抗结核药物治疗方案，尽早阻断MDR-TB的传播。表型DST方法检测耐药不需要考虑耐药机制及分子生物学基础，可在固体或液体培养基上直接或间接进行。固体培养常用方法有比例法、绝对浓度和抗性比率法；液体培养系统主要是比例法，这些方法对于一线抗结核药物有着良好的一致性。

《手册》[2]同时提到了一些非商品化培养及DST检测方法可用作临时解决方案应用于资源有限且有待发展基因型DST检测的实验室。其中，显微镜观察药敏技术(MODS)、比色法、硝酸还原酶分析法(NRA)的成本较低。这些非商品化的检测方法与常规培养及DST同样需要生物安全措施，因此仅适用于中央或具备生物安全条件的区域级实验室。二线药物的DST，采用肉汤或液体培养基及固体培养的比例法的检测结果相似，但仍有待建立准确度高和可重复性强的标准方法。

《手册》[2]指出，MDR-TB的快速分子检测不排除对常规培养和药敏试验的需求。培养主要用于MDR-TB患者的疗效监测和执行二线药物的DST检测。《手册》[2]中提及的目前惟一的一个商品化的XDR-TB分子检测方法，WHO并不建议使用。专家组在2012年评估获得的证据认为，检测氟喹诺酮类和二线注射药物的MTBDRsl线性探针基因型检测方法的特异度高、敏感度稍差，其分析结果无法确定最适合的氟喹诺酮类或注射药物用于针对性的治疗方案。当前，表型DST技术是检测XDR-TB的参考方法。商品化的液体培养被认为是最快且可靠的二线药物DST方法。

七、DST的局限性

DST的可靠性因药物而有所不同。一线药物的DST，利福平和异烟肼可靠性最高，链霉素、乙胺丁醇和吡嗪酰胺可靠性和可重复性较低(吡嗪酰胺的检测只能在液体培养基调整到适当的pH值时才能进行)。二线药物中可注射类药物(阿米卡星、卡那霉素和卷曲霉素)和氟喹诺酮类药物的可靠性和可重复性强。其他二线药物DST可靠性和可重复性的数据有限，其中有些方法还尚未建立或者没有标准。此外，DST相关结果对临床预后有指导意义的数据仍不足。

利福平耐药的表型DST和基因型DST方法不完全一致。新证据表明，rpoB基因DNA测序(基因型DST检测的金标准)尽管并不完美但较表型DST是一个更好的参考方法。针对这一问题，WHO将继续搜集和评估新的数据，待获得充足数据时，将进一步评估表型耐药检测标准的准确性。

八、交叉耐药

交叉耐药及对耐药结核病分子机制了解的不足使问题进一步复杂化。新的证据显示，对于多数药物的表型耐药与特异的分子突变有着明确的联系；但是，尚未确定所有二线药物的耐药突变，即便已经检测到的耐药突变的分子机制也未被阐明。

基本实验室服务、机构设置、安全与质控

《手册》[2]中突出了基本实验室服务的两项重要任务，其一是服务于临床需求；其二是服务于整个耐药结核病防控体系。

由于资源和能力的不平衡，实验室需要分级提供相应的服务，以及与之配套的机构设置工作，其中最基本的是保证开展对一线抗结核药物利福平和异烟肼进行DST。对其他抗结核药的DST 可以根据实际情况逐级实施，并且将不同级别的实验室联接成服务互补的网络以发挥更大的效能。为保证检测的准确性和一致性，各实验室都应该制订质量管理系统(quality management system，QMS)。QMS 应当包括标准操作流程(standard operating procedures，SOPs)、室内质控(internal quality control， IQC)及室间质量评估(external quality assessment，EQA)等部分。此外，需要加强实验室工作人员的培训与工作流程监督，以控制实验室获得性结核感染的发生。

结核病实验室网络的构建及临床样本的收集与运输

结核病实验室网络的构建及临床样本收集与运输在《手册》[2]中分为前后两部分进行论述，实际上这两部分内容是一个整体。构建结核病实验室网络的主要目的是解决资源和技术短缺，以及不能满足实际耐药结核病诊断需求的问题，以最大限度发挥现有资源和技术的效能。《手册》[2]中所提及的结核病实验室网络主要是一种树形结构，其将实验室从基层(level Ⅰ)到中心(level Ⅲ) 分为三级实验室。每级实验室均有不同的工作侧重，中间有专门的样本转运系统进行衔接。

DST 的合理应用及报告时间

DST 的合理应用及报告时间也是《手册》[2]中相互密切关联的两部分内容。DST 的WHO 政策指南主要遵循之前发表的相关原则[10]，这些原则主要考虑到实验室能力、DST 的准确性、临床实际需求、防控需求、效率，以及报告时间等因素来制订。其中，检测报告时间是早期诊断的重要指标。不同检测方法的报告时间也有差异，如传统培养的方法以周计、LPAs 的方法以天计，Xpert Mtb/RIF 以小时计。由于现有方法之间是一种互补关系，目前主要应该对各种方法进行合理的使用，同时将各种方法的检测报告时间标准化，以使制订的原则真正发挥效力。

总结与展望

笔者主要对《手册》[2]有关耐药结核病实验室检测部分进行了初步的解读，对耐药结核病实验室检测相关的概念和技术进行了梳理，同时对其他内容也进行了简要的概述。目前耐药结核病防控形势依然严峻，相关研究逐渐增多，新的诊断技术方法也不断被引进和应用，同时相关的概念和实际检测技术也在不断地发展。DST检测技术的发展并不能完全解决耐药结核病实验室检测相关的全部问题，还需要从实验室的机构设置、网络形成、质量控制、人员培训及制订相关规范流程等多方面进行综合考虑。

结合我国目前耐药结核病流行病学现状，笔者认为《手册》[2]中本章节关于实验室检测的相关问题及解决方案具有极高的参考价值。但由于国情不同，笔者认为仍然有很多关于耐药实验室检测的特殊问题《手册》[2]中并没有重点提及或关注，如：在不同经济发展水平的地区建立相适应的实验室构架及区域性或全国性的网络；在人口大规模流动的背景下，固定的树形实验室网络是否可以与之相适应并发挥实际的防控功能。因此，结合《手册》[2]的相关内容及我国实际情况，有必要进一步制订符合我国国情的相关指南、指导手册及政策，以更好地服务于我国的耐药结核病防控工作。

[1] World Health Organization. Policy framework for implementing new tuberculosis diagnostics. WHO/HTM/TB/2010.07. Geneva：World Health Organization, 2010.

[2] World Health Organization. Companion handbook to the WHO guidelines for the programmatic management of drug-resistant tuberculosis. WHO/HTM/TB/2014.11. Geneva：World Health Organization, 2014.

[3] World Health Organization. Guidelines for the programmatic management of drug-resistant tuberculosis-Emergency update 2008. WHO/HTM/TB/2008.402. Geneva：World Health Organization, 2010.

[4] World Health Organization. A roadmap for ensuring quality tuberculosis diagnostics services within national laboratory strategic plans. WHO/HTM/TB/2010. Geneva：World Health Organization, 2010.

[5] 张洁，邢青，王甦民，等. 传统培养法与PCR-荧光探针法鉴定分枝杆菌的对比研究. 中国防痨杂志，2015，37(3): 291-294.

[6] 王桂荣，付育红，梁倩，等. 应用多重PCR方法快速鉴定结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌的研究. 中国防痨杂志， 2013，35(9): 686-689.

[7] World Health Organization. Automated real-time nucleic acid amplification technology for rapid and simultaneous detection of tuberculosis and rifampicin resistance: Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of pulmonary and extrapulmonary TB in adults and children: policy update. WHO/HTM/TB/2011.4. Geneva：World Health Organization, 2011

[8] World Health Organization. Rapid implementation of the XpertMTB/RIF diagnostic test. WHO/HTM/TB/2011. Geneva：World Health Organization, 2011.

[9] 唐神结，许绍发，李亮. 耐药结核病学. 北京：人民卫生出版社，2014：103-108.

[10] World Health Organization. Policy guidance on drug-susceptibility testing (DST) of second-line antituberculosis drugs. WHO/HTM/TB/2008. Geneva: World Health Organization, 2008.

(本文编辑：薛爱华)

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.06.018

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2015-05-04)