中药和植物蛋白原料混合发酵生产鱼类生物饲料的初步研究

■谢炎福张 爽

（1.洛阳师范学院生命科学系，河南洛阳 471022；2.锦州市动物疫病预防控制中心，辽宁锦州 121000）

随着肉禽蛋奶中抗生素等药物残留问题的日益显现，各国畜禽、水产鱼类研究人员都在积极探索动物健康养殖的新途径。中草药由于安全、天然、有效、无残留等优点日益引起人们的重视，并在动物饲料中广泛使用；但也存在用药量大、口感差（发苦）、使用麻烦、提取成本高等缺点。微生物对中药进行发酵是我国中药炮制领域的一项传统技术，中药经发酵后可以显著提高药效、减少药物用量、改善动物口感，在畜禽方面的应用均取得了令人满意的效果。我国饼粕类资源丰富，其中尤以豆粕、棉粕和菜粕产量最大，是我国畜禽水产饲料的主要植物性蛋白饲料原料来源。由于这些原料中蛋白质的相对分子质量较大，且含有棉酚、硫甙等抗营养成分，限制了他们在饲料中的用量，通过微生物对植物原料进行发酵处理，可以改善饲料品质，降低有害物质含量，饲喂益生菌发酵饲料，可以提高水产动物的生产性能和抗病能力。将益生菌发酵饲料与微生物发酵中药这两项技术，通过益生菌这一纽带结合起来，共同促进鱼类健康养殖是一项很值得探讨的研究课题，本次研究旨在探讨加入复合中药对植物蛋白原料微生物发酵的影响，并就复合中药和植物饼粕混合生物发酵饲料对草鱼鱼种生长和非特异性免疫的影响进行了初步研究，为新型生物饲料的开发研制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种

米曲霉（Aspergillus oryzae）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subitilis）、植物乳酸菌（Lactobacillus plantarum）、产朊假丝酵母（Candida utilis）均为本实验室内保存。

1.1.2 原料

豆粕：粗蛋白含量46%；棉籽饼：粗蛋白含量34.53%、游离棉酚含量775 mg/kg；菜粕：粗蛋白含量36.8%、硫苷含量87.35 μmol/g；麸皮：粗蛋白15.2%，均为市售，粉碎备用。

1.1.3 中草药

组方为：黄芪18（重量份数，以下同）、党参12、当归10、白术8、茯苓4、柴胡3、陈皮3、山楂4、麦芽6、茵陈4、黄芩6、板蓝根4、大黄4、甘草6、生姜3。以上中草药均购自洛阳药材市场，在60℃干燥培养箱中烘干2 h，烘干后按照上述配方比例混合，在粉碎机中粉碎，过40目筛，备用。

1.1.4 实验用鱼

实验用草鱼（Ctenopharyngodon idellus）购自吉利良种场，平均体重（31±1）g，用3%食盐水浸泡消毒15 min，饲养在有增氧过滤装置的水族箱中。

1.1.5 培养基

真菌培养基：查氏培养基；芽孢杆菌培养基：牛肉膏蛋白胨培养基；乳酸菌培养基：MRS培养基；酵母培养基：马铃薯培养基。

基础饲料配方：鱼粉5%、植物油2%、多维和矿物质3%、发酵基料90%(豆粕20%、菜粕20%、棉粕10%、麦麸15%、次粉15%、玉米10%)。粗蛋白29.87%、粗脂肪4.02%、蛋氨酸0.50%、赖氨酸1.47%。

固体发酵培养基：发酵基料另加入基料重量1%的硫酸铵即为发酵培养基。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵种子液的制备

酵母菌接种到查氏液体培养基，枯草芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基，在温度32℃，转速100 r/min的恒温摇床上振荡培养24～32 h，调整活菌数达到1×108个/ml，即为枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母种子液。将经活化的米曲霉斜面孢子用无菌水冲洗下来，制成孢子浓度为1×107个/ml的孢子悬液，即为米曲霉种子液。植物乳酸菌接种到MRS培养基中，32℃静置培养12 h。

1.2.2 中药、植物原料混合发酵流程和实验设计

选择30个250 ml的三角瓶，每个三角瓶放入50 g 1.1.5中所述固体发酵培养基，按照随机数字分组的方法分成10组，分别为阴性对照组A，仅有发酵固体培养基，不加中药，不进行发酵；阳性对照组B，仅有发酵培养基，不加中药，进行发酵；另8组分别加入占发酵培养基0.11%、0.33%、0.55%、0.77%、1.1%、3.3%、5.5%、8.8%的中药（发酵培养基按1.1.5所述90%比例加入草鱼鱼种饲料，分别约相当于配合饲料量的0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、1%、3%、5%、8%），分别命名为C、D、E、F、G、H、I、J组，每组3个重复，搅拌混合均匀，调整至60%含水量，115℃灭菌20 min。自然冷却后将物料打散，在自然pH值下，总接种量12%，按照米曲霉、枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母、植物乳酸菌1∶2∶1∶1的比例分别将4种菌接种到物料中，在32℃，先好氧发酵48 h，然后厌氧发酵48 h，好氧发酵用纱布封口，厌氧发酵用塑料布封口，发酵结束后，将发酵饲料在50℃烘箱中烘干，粉碎，备用。

1.2.3 中药单独发酵

按照1.1.3所述中药组方配制中药，调整含水量调整至65%，在自然pH值下，按照米曲霉、枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母、植物乳酸菌1∶2∶1∶1的比例分别将4种菌接种到物料中，4种菌接种量之和为物料的10%，在发酵罐中32℃先好氧发酵48 h，升温至36℃厌氧发酵36 h，发酵结束后，烘干备用。

1.2.4 草鱼饲养与实验设计

将购回的草鱼幼鱼在室内玻璃水族箱中暂养7 d，暂养期间投喂基础饲料，试验期间水温24～28℃，每天清除污物，2 d换水一次。待草鱼适应水族箱环境后，挑选规格整齐，无伤病的草鱼600尾，按照随机数字分组的方法分为5个处理，每个处理6个重复，每个重复20尾鱼。分别投喂以下饲料，K阴性对照组：投喂基础饲料；L阴性中药组投喂发酵饲料（将基础饲料中发酵基料部分按照1.2.2中所述方法进行发酵后，其它成分不变，考虑到发酵过程中物料的损耗，损耗部分以粉碎的秸秆粉代替，以下同）；M阳性中药组投喂发酵饲料+0.3%中药；N投喂发酵饲料+0.3%单独发酵的中药；P投喂发酵饲料+0.3%和发酵基料混合发酵的中药。饲料粒径1.5 mm，每天投喂3次，每次投喂量为鱼体重的3%～4%，实验共60 d。

1.3 测定及分析方法

采用游离棉酚的测定：参照GB/T 13086—1991；粗蛋白质测定：采用凯氏定氮法；硫甙的测定：采用氯化钯分光光度法；乳酸含量的测定：参照明恒磊的方法进行，略有改动。

脱毒率（%）=100×（原料中含量-发酵后含量）×原料中含量。

微生物计数方法：微生物计数方法采用稀释平板法。

生长指标的测定：计算增重率、饵料系数，各指标计算公式：

WGR（%）=(Wt-W0)/W0×100；

FCR=F/(Wt-W0)。

式中：WGR——增重率(%)；

Wt——第t天后各组鱼平均体重(g)；

W0——初始时各组鱼平均体重(g)；

FCR——饵料系数；

F——t天内各组的饲料摄取量(g)。

血液生化指标的测定：在实验的第61 d，对各组鲤鱼随机取样，取样前停食1 d，采用尾动脉抽血的办法，每尾鱼采血1 ml，取3尾草鱼的血液在3 000 r/min的冷冻离心机中离心15 min，参照文献的办法，测定血清谷草转氨酶（GOT）、谷丙转氨酶（GPT）、肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LSZ）的活性和丙二醛（MDA）含量，相关测定试剂盒均购自于南京建成生物工程研究所科技有限公司。

头肾体指数(HKBI)和脾脏体指数(SBI)的测定：先称量实验鱼体重，采血后，摘取脾脏和头肾，用生理盐水冲洗干净，吸水纸吸干表面水分，在电子天平上称重。

免疫器官指数（%）=（免疫器官重量/体重）×100。

1.4 数据处理

所有数据采用SPSS软件进行方差分析，多重比较采用LSD法。

2 结果与分析

2.1 植物原料中加入中药对发酵结果的影响(见表1)

随着固体发酵培养基中复方中药量的增加，总菌数、棉酚去除率、硫甙去除率、乳酸含量均呈现先增加后减少的趋势，总菌数最高的为H组，即培养基中3.3%的中药添加量总菌数最高；棉酚去除率最高的为F组，即0.77%的中药添加量，棉酚去除率最大；硫甙去除率最大为G组，即1.1%的中药添加量，硫甙去除率最大；乳酸含量最高的为D组，即0.33%的中药添加量，乳酸含量最高。总菌数中药添加量0.77%、1.1%、3.3%的F、G、H组显著高于A、B、C、I、J组（P＜0.05)，其它各组间无显著差异（P＞0.05)；棉酚去除率B、C、D、E、F、G、H组显著高于A、I、J组（P＜0.05)，硫甙去除率B、C、D、E、F、G组显著高于A、I、J组（P＜0.05)，I、J组显著高于A组（P＜0.05)，其它各组之间无明显差异（P＞0.05)；乳酸含量A、I、J组显著低于其它各组（P＜0.05)，考虑到中药用量，且D组考察的各项指标和最优组之间均无显著差异（P＞0.05)，以固体发酵培养基中添加0.33%复方中药为宜，即折合草鱼饲料中添加0.3%中药。

表1 中药对植物原料混菌发酵的影响

2.2 中药、植物原料共发酵对草鱼鱼种生长的影响（见表2）

表2 中药和植物原料共发酵对草鱼生长的影响

增重率从大到小依次为P组＞N组＞M组＞L组＞K组，饵料系数从大到小依次为K组＞L组＞M组＞P组＞N组。增重率N组和P组显著大于其它各组（P＜0.05），L组和M组显著大于K组（P＜0.05），其它各组间无显著差异（P＞0.05）；饵料系数除N组和P组间无显著差异（P＞0.05）外，其它各组之间差异显著（P＜0.05）。

2.3 中药、植物原料共发酵对草鱼鱼种非特异性免疫的影响（见表3）

表3 中药和植物原料共发酵对草鱼非特异性免疫的影响

LSZ、SOD、头肾指数（HKBI）、脾脏指数从大到小依次为N、P组＞M组＞L组＞K组，丙二醛从大到小依次为K组＞L组＞M组＞P组＞N组。头肾指数各组间无显著差异(P＞0.05)；脾脏指数N组、P组显著大于K、L、M组(P＜0.05)，其它各组间无显著差异（P＞0.05）；丙二醛N组、P组显著低于K、L、M组(P＜0.05)，M组显著低于K组（P＜0.05），其它各组间无显著差异（P＞0.05）；SOD N组、P组显著大于K、L、M组（P＜0.05），M组显著大于K组（P＜0.05）；LSZ N组、P组显著大于K、L组（P＜0.05），L、M组显著大于K组（P＜0.05）。

2.4 中药、植物原料共发酵对草鱼鱼种肝肾器官的影响（见表4）

表4 中药和植物原料共发酵对草鱼鱼种内脏器官的影响

GOT、GPT、Cr、BUN从大到小依次为K组＞L组＞M组＞P、N组。BUN各组间无显著差异(P＞0.05)；GPT K组显著高于其它各组(P＜0.05)，N、P组显著低于L组（P＜0.05），其它各组间无显著差异（P＞0.05）；GOT N组、P组显著低于K、L组（P＜0.05）；肌酐K组显著高于其它各组（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 植物蛋白原料中添加中药对发酵的影响

豆粕、棉粕、菜粕等植物蛋白原料经发酵后棉酚、硫甙等抗营养因子大幅降低，并产生了乳酸等有益鱼类生长的物质，说明微生物发酵是提高植物蛋白原料价值的有效手段。植物蛋白原料加入中药后，在0.11%～0.77%的浓度范围内，微生物的总数大幅增加，棉酚和硫甙的去除率以及乳酸含量均得到了不同程度的提高，说明中药在低浓度时有利于发酵的进行，这可能和中药中含有多种氨基酸、微量元素、无机盐等有益于枯草芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌生长繁殖的成分有关。随着发酵基质中中药量的增加，在添加量大于3%时，微生物的生长受到抑制，棉酚和硫甙的去除率以及乳酸含量亦下降，说明中药在高浓度时不利于发酵的进行，这与唐艳红等的研究结果类似。多种饼粕类低质蛋白原料和中药混合发酵，可以简化生产程序，更利于棉酚、硫甙等抗营养因子的去除以及乳酸等有益成分的增加，与单独发酵然后再混合相比较更有优势。值得注意的是，经灭菌后，棉酚和硫甙含量均大幅下降，说明高温灭菌也有利于棉酚和硫甙的降解。

3.2 中药和植物蛋白原料共同发酵对草鱼鱼种生长的影响。

本研究结果表明，复合中药和植物蛋白原料经混合菌种发酵后，增重率较K、L、M 3个对照组分别提高了37.8%、14.3%和11.6%，饵料系数降低了17.2%、12.7%和9.4%，说明复合中药和植物低值饼粕类原料共同发酵能有效促进草鱼鱼种的生长和提高饲料报酬。经混合菌种发酵后，虽然发酵过程中消耗了部分能量物质，但产生了一定量的菌体蛋白以及大量维生素、乳酸等微生物代谢产物，植物原料及中药中大分子的蛋白质、淀粉等分解成小肽、氨基酸、葡萄糖等小分子物质，组成植物细胞壁的纤维素、半纤维素等转化为可被草鱼利用的成分。中药中含有黄酮、苷类等活性物质，这些成分具有促进食欲，增强机体代谢活动，促进消化酶分泌等作用，加速水产动物的生长发育，经发酵后，这些物质更易被鱼类利用。中药和植物蛋白原料共同发酵和中药、植物蛋白原料分别发酵的实验组没有显著差异，而从生产工艺上来说，明显的混合发酵优于单独发酵。

3.3 中药和植物蛋白原料共同发酵对草鱼鱼种非特异性免疫的影响

SOD在活性氧自由基清除、防止细胞损伤方面有重要作用；丙二醛反映细胞膜脂质过氧化的程度。中药和植物蛋白原料共同发酵后，草鱼SOD的升高伴随着丙二醛含量的下降，说明饲喂混合发酵饲料有助于草鱼鱼种抗氧化能力的提高。本研究结果表明，血清溶菌酶能够抵抗病原侵入，增强鱼类抗病能力，饲喂添加0.3%中药的发酵饲料后显著提高了草鱼鱼种血清溶菌酶含量，反映鱼类抗病能力增强，这对保护鱼体健康，提高免疫力具有一定的积极意义。脾脏和头肾为鱼类的免疫器官，脾脏指数和头肾指数的增大，反映植物原料中添加中药共同发酵对草鱼鱼种免疫器官的发育具有促进作用，豆粕、菜籽粕和棉粕中含有胰蛋白酶抑制因子、棉酚、硫甙等毒性物质，能引起鱼类机体代谢紊乱，肝、肾肿大，出现肝出血和坏死等症状。经微生物发酵后，这些毒性物质得到分解、去除，配方中草药中含有大量的有机酸、生物碱、免疫多糖和黄酮等活性物质，能够有效调整机体的机能紊乱和增强机体对有害刺激的抵抗力，促进溶菌酶含量的提高和头肾、脾脏等免疫器官的发育。

3.4 中药和植物蛋白原料共同发酵对草鱼鱼种肝、肾内脏器官的影响

谷草转氨酶和谷丙转氨酶主要由鱼类肝脏合成，正常情况下血液中含量稳定，它的升高往往反映了肝脏器官的损伤，肌酐和尿素氮由肾脏排出体外，含量高低反映了肾脏器官的功能状况。中药和植物原料经发酵后，GOT、GPT、Cr、BUN含量均有所下降，发酵过程中，植物原料中多种毒性物质被微生物降解，降低了对草鱼肝脏、肾脏、脾等内脏器官的刺激作用，这和发酵过程中棉酚、硫甙等有害物质的下降是一致的。复方中药中含有的茵陈、白术等药物有助于肝脏器官的损伤修复，中药经多菌种发酵后，由于物理“破壁效应”，有利于植物细胞中各种活性成分和营养成分的溶出，发酵方法条件温和，避免了传统蒸煮、有机溶剂提取的高温等极端环境，使复合中药中的部分活性成分得以保留，促进了鱼类的生长，使抗病能力得以提高，且中药、微生物相互作用，有可能产生了新的有助于保护鱼类健康的生物活性成分。

3.5 多种方式，多靶点的共同作用

植物蛋白原料和中药经发酵后，利用率得以提高，微生物利用植物原料和中药为基质得以繁殖，中药中部分成分促进微生物生长，生长过程中产生多种维生素和未知促生长因子，且混合菌种中的枯草芽孢杆菌、乳酸菌可以在鱼类肠道中定植，发挥生物夺氧，改善肠道环境等作用，抑制有害微生物的繁殖，互相促进，共同提高了鱼类的生长和抗病能力。

4 总结

中药在0.11%～0.77%的添加量时，有利于植物原料发酵过程中棉酚、硫甙的降解和乳酸含量的提高，在添加量大于3%时，不利于植物原料的微生物发酵；植物蛋白原料中添加0.3%的复方中药共同发酵后，相比较对照组，增重率提高了37.8%，饵料系数降低了17.2%，显著提高了草鱼鱼种的非特异性免疫能力，对草鱼内脏器官具有一定保护作用；中药和植物原料单独发酵和混合发酵均对草鱼鱼种的生长和非特异性免疫能力的提高具有促进作用，但两者之间没有显著差异。

（参考文献18篇，刊略，需者可函索）