七氟烷预处理联合后处理对肺缺血再灌注损伤大鼠的保护作用及机制

刘备，唐冬梅，杜宁，徐桂萍

(1石河子大学医学院，石河子832000;2新疆维吾尔自治区人民医院)

肺缺血再灌注损伤(IRI)多发生于肺移植、失血性休克、体外循环后，IRI发生时，肺组织缺血后的再灌注不仅不能使肺功能恢复，反而可加重肺功能障碍和结构损伤，并最终发展为急性肺损伤(ALI)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)［1］。肺移植时，IRI发生率高达25%［2］。IRI机制较多，其中氧自由基及炎症反应等是主要因素［3］。七氟烷是临床常用吸入麻醉药，具有血气分配系数低、诱导苏醒快、血流动力学稳定等优点。有学者已证明七氟烷对急性肺损伤的保护作用优于其他吸入麻醉药［4］，且该种保护作用与减轻脂质过氧化、减少炎症介质释放有关［5］。本研究在建立IRI大鼠基础上，拟探讨七氟烷预处理联合后处理对IRI大鼠的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 新疆医科大学动物实验中心提供的成年雄性SD大鼠54只，体质量300～350 g。七氟烷(Maruishi Pharmaceutical公司)，TNF-α 测定试剂盒(北京永辉生物科技有限公司)，逆转录试剂盒(Thremo公司)，超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。小动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司)。凝胶图像分析系统(Bio-Rad公司，美国)。

1.2 IRI模型制作及动物分组 采用随机数字表法将54只SD大鼠分为假手术组(S组)、肺缺血再灌注组(I/R组)和七氟烷预处理联合后处理组(SP组)各18只。参照文献［6］采用Epinger方法制备IRI模型。腹腔注射20%乌拉坦4 mL/kg进行麻醉，仰卧位固定;游离颈内静脉，行颈内静脉穿刺并置管，持续输注生理盐水;游离气管，行气管切开并插管，接小动物呼吸机行机械通气，通气频率65～70次/min，潮气量10～15 mL/kg，呼吸比1.0∶1.5。呼吸机的进气口与装有七氟烷挥发罐的麻醉机呼吸回路末端相连。通气30 min后，将大鼠改为右侧卧位，左侧第5肋间入胸，离断左下肺韧带，游离左肺门，经由颈内静脉三通处注射50 U肝素，5 min后，于呼气末采用无创血管夹夹闭左肺门(包括左主支气管、左肺动、静脉)，通气时肺组织不再膨胀，颜色由淡红变为暗紫红色，表明阻断成功。阻断45 min后松开血管钳恢复血液循环和通气形成再灌注，观察5 min内肺组织膨胀，颜色逐渐恢复，表明再灌注成功。S组仅游离左肺门，不阻断;I/R组按上述方法制备IRI模型;SP组吸入2.1%七氟烷30 min后，停止吸入洗脱10 min，然后阻断左肺门45 min，并于松开血管夹即刻再次吸入2.1%七氟烷30 min制备IRI模型。

1.3 观察指标及方法 ①血浆SOD活性。分别于再灌注30、60、120 min时各组随机取6只大鼠，做死亡心脏采血，吸取血液2 mL加入含肝素溶液的试管中，3 000 r/min离心20 min后取上清，采用比色法检测SOD活性。②肺组织中TNF-α表达。分别于再灌注30、60、120 min时各组随机取6只大鼠处死，取部分肺组织，采用ELISA法测定TNF-α。③肺组织湿/干质量比(W/D比)。切取大鼠部分肺组织，生理盐水冲干肺上血迹，滤纸吸干表面水分，称得湿质量(W值)后将该肺组织置于风箱中12 h至横重，称得干质量(D值)，二者相比得W/D值。④血管紧张素转化酶(ACE)mRNA表达。取部分－80℃冰箱保存的左肺组织，采用TRIzol法处理、分离、RNA沉淀、RNA洗涤、RNA溶解提取总RNA，并测定其浓度和纯度，逆转录试剂盒合成反转录cDNA，然后进行RT-PCR反应。取所得PCR产物5 μL点样于2%的琼脂糖凝胶进行电泳，用凝胶图像分析系统扫描测定PCR扩增条带的吸光度值，以ACE mRNA条带吸光度值与β-actin条带吸光度值的比值表示ACE mRNA水平。⑤肺组织病理学改变。取出部分左肺组织，10%中性甲醛固定过夜，脱水，石蜡包埋，连续切片(厚4 μm)，HE染色，100倍光镜下观察病理学变化。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以±s表示，组间及组内比较采用方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组肺组织W/D、TNF-α 表达、ACE mRNA表达及血浆SOD活性比较 三组大鼠各个时点肺组织W/D、TNF-α表达、ACE mRNA表达及血浆SOD活性水平的比较见表1。

2.2 各组肺组织病理学结果比较 光镜下，S组肺组织未见明显异常。I/R组肺泡结构破坏严重，肺泡腔内可见大量红细胞及炎性细胞浸润，且I/R组120 min组织破坏最为严重，SP组肺组织病理学损伤较I/R组轻。

表1 三组不同时点肺组织中W/D、TNF-α、ACE mRNA表达及血浆SOD活性水平比较(n=6，±s)

表1 三组不同时点肺组织中W/D、TNF-α、ACE mRNA表达及血浆SOD活性水平比较(n=6，±s)

注:与同组再灌注30 min时相比，*P＜0.05;与同组再灌注60 min时相比，ΔP＜0.05;与S组同时间点相比，○P＜0.05;与I/R组同时间点相比，□P ＜0.05。

组别 W/D SOD(U/mgprot) TNF-α(pg/mg)ACE mRNA S 组再灌注 30 min 4.529 ±0.169 33.27 ±2.85 43.03 ± 3.93 0.36 ±0.08再灌注 60 min 4.384 ±0.282* 36.42 ±2.45* 48.83 ± 4.82* 0.40 ±0.06*再灌注120 min 4.583±0.264*Δ 34.38±2.28*Δ 49.80± 3.87*Δ 0.43±0.09*Δ I/R组再灌注30 min 5.007 ±0.151○ 24.28±1.34○ 219.19 ±14.15○ 0.70±0.09○再灌注60 min 5.180±0.101＊○ 21.03±1.72＊○ 253.73±15.47＊○ 0.82±0.07＊○再灌注120 min 5.534 ±0.201*Δ○ 18.18±1.42*Δ○ 299.67 ±16.61*Δ○ 0.92±0.04*Δ○SP组再灌注30 min 4.736±0.141○□ 28.15±1.63 ○□ 150.18± 4.67○□ 0.49±0.08○□再灌注60 min 4.957±0.166＊○□ 26.78±1.25＊○□ 167.68± 4.64＊○□ 0.66±0.05＊○□再灌注120 min 5.307 ±0.107*Δ○□ 23.49 ±1.60*Δ○□ 189.25 ± 4.35*Δ○□ 0.77 ±0.04*Δ○□

3 讨论

IRI时肺内氧自由基大量生成，致使肺脂质过氧化，造成肺内毛细血管及气道损伤［7］;与此同时，这种损伤促使肺内炎症介质释放，激活IRI的炎症反应［8］。

SOD是生物体内重要的抗氧化酶，在IRI过程中可抑制肺脂质过氧化反应，减少氧自由基损害。Yang等［9］研究证实缺血再灌注开始即刻便有大量活性氧物质生成，发生氧化应激反应，本实验中I/R组较S组各时点SOD活性降低，证实了以上观点;而经由七氟烷联合处理后，SP组较I/R组各时点SOD活性均升高，表明七氟烷联合处理后肺内SOD活性增加，氧化应激反应减轻。

目前，IRI的详细机制尚未明了，其特征性病理变化为肺毛细血管内皮细胞受损后，肺泡—毛细血管屏障功能障碍，使炎症细胞和炎性介质渗出，肺泡及肺泡间质水肿，组织细胞死亡［10］。肺组织中含有丰富的ACE，ACE mRNA表达上调可促使AngⅡ产生，同时伴有少量TNF-α的生成，进而激活炎症反应［11］。W/D比则可通过肺微血管损伤情况反映IRI程度，本实验中，光镜下I/R组较S组肺组织破坏严重，且肺组织W/D、TNF-α及ACE mRNA表达水平均升高，提示ACE mRNA及TNF-α表达可使毛细血管扩张充血，诱导炎性细胞浸润，造成肺泡间隔水肿增宽。随再灌注时间的延长，肺组织损伤逐渐加重，I/R组120 min组织破坏最为严重，表明IRI具有时间相关性。七氟烷联合处理后，SP组较I/R组肺组织W/D、TNF-α及ACE mRNA表达水平均降低，表明七氟烷联合处理可通过抑制肺内ACE mRNA及TNF-α表达，减轻IRI的炎症反应，发挥肺保护作用。

综上所述，七氟烷预处理联合后处理可能通过抑制氧化应激及炎症反应对IRI大鼠发挥保护作用。

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