染色质免疫共沉淀(ChIP)

染色质免疫共沉淀(ChIP)

染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay，CHIP)是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

ChIP具体操作流程：

第一天：

一、细胞的甲醛交联与超声破碎。

1.取出细胞，加入甲醛，使得甲醛的终浓度为1%。

2.37摄氏度孵育10 min。

3.终止交联。

4.吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。

5.细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中。预冷后离心收集细胞。

6.倒去上清。

7.超声破碎。

二、除杂及抗体哺育

8.超声破碎结束后，离心去除不溶物质。

9.在100 ul的超声破碎产物中，加入900 ul ChIP Dilution Buffer和20 ul的50×PIC。再各加入60 ul ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA。4℃颠转混匀1 h。

10.1 h后，在4摄氏度静置10 min沉淀，700 rpm离心1 min。

11.取上清。各留取20 ul做为input。一管中加入1 ul抗体，另一管中则不加抗体。4℃颠转过夜。

三、检验超声破碎的效果

取100 ul超声破碎后产物，加入4 ul 5M NaCl，65℃处理2 h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。

第二天：

免疫复合物的沉淀及清洗

12.孵育过夜后，每管中加入60 ul ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA。4℃颠转2 h。

13.4℃静置10 min后，离心除去上清。

14.清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4℃颠转10 min，4℃静置10 min沉淀，700 rpm离心1 min，除去上清。

15.清洗完毕后，开始洗脱。

16.解交联：每管中加入20 ul 5M NaCl(NaCl终浓度为0.2 M)。混匀，65℃解交联过夜。

第三天：

一、DNA样品的回收

17.解交联结束后，每管加入1 ul RNaseA(MBI)，37℃孵育1 h。

18.每管加入10 ul 0.5M EDTA，20 ul 1M Tris.HCl(PH6.5)，2 ul 10 mg/ml蛋白酶K。45℃处理2 h。

19.DNA片段的回收-omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100 ul ddH2O。

二、PCR分析

·消息·