他汀类药物抗骨质疏松作用的实验研究进展

项力源 田发明 刘会仁 胡克俭 刘家寅

他汀类药物是 3- 羟基 -3- 甲基戊二酰辅酶 A ( 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A，HMG-CoA ) 还原酶抑制剂，通过抑制胆固醇合成链中的限速酶 HMG-CoA 还原酶，来减少胆固醇的合成[1]。1999 年 Mundy 等[1]首次发现，他汀类药物有激活成骨细胞、促进骨合成代谢的作用。随后有研究者发现，辛伐他汀能在体内和体外环境下通过提升骨形态发生蛋白 ( bone morphogenetic protein，BMP ) 2 和碱性磷酸酶 ( alkaline phosphatase，ALP ) 的表达水平刺激骨形成，还可以刺激骨髓间充质干细胞 ( bone marrow mesenchyme stromal cells，BMSCs ) 向成骨细胞分化[2-3]。大量的体外研究实验证实，在体外环境下，他汀类药物能够有效的刺激成骨细胞的增殖与分化；而在动物体内实验中发现，肝脏对药物有消除作用，血液中的药物浓度只有 5%[4]。因此，探索一种有效的给药途径与给药剂量成为广泛临床应用的关键问题。

一、他汀类药物理化性质

以往诸多研究表明他汀类药物能有效降低血液中低密度脂蛋白胆固醇，但由于他汀类药物的亲脂亲水性和化学结构的差异，会导致药物作用机制不尽相同。他汀类药物可通过胃和小肠部位吸收，主要的第一遍选择性吸收在肝脏，通过被动扩散经肝细胞的细胞膜主要负责亲脂性他汀类药物的肝摄取；而亲水性他汀类药物通过活性载体的介导，经肝微粒体酶系代谢，代谢产物从胆汁排泄，很少从肾脏代谢，进而引起对于人体不同组织器官的作用效果的差异[5]。辛伐他汀具有较强的亲脂性，近些年对于辛伐他汀促进成骨作用的报道增多，大量文献也表明辛伐他汀通过不同的机制促进骨形成，包括临床药物研究、体外细胞实验和体内动物实验[6]。

二、药理活性

1. 体内给药：即使存在肝脏的首过消除作用，口服给予辛伐他汀促进骨形成的报道并不少见。Ho 等[7]在去卵巢大鼠模型中口服给予辛伐他汀 ( 10～20 mg / kg / day )，发现辛伐他汀能够显著提升股骨远端、胫骨近端和椎骨骨小梁的体积，增加成骨细胞数量；免疫组化染色显示胫骨BMP2、I 型胶原 ( Collagen I，COL I ) 和骨钙素 ( osteocalcin，OCN ) 蛋白表达增加，这说明口服辛伐他汀能够防止去卵巢大鼠的骨量丢失，促进骨形成。蔡羽中等[8]在辛伐他汀与BMP2 促进兔桡骨骨折愈合的对比观察中发现，口服辛伐他汀与骨折处局部注射 BMP2 在促进骨痂的形成、改建及骨髓腔的再通率相差不大 (P＞0.05 )，均能促进胶原纤维、软骨组织、骨小梁及骨基质的形成。

2. 体外给药：田发明等[9]用辛伐他汀刺激体外诱导培养的大鼠 BMSCs 成骨分化，辛伐他汀 ( 10-7M ) 组 ALP 活性明显高于对照组，在大鼠 BMSCs 基因表达谱的 22 575 个基因中共检测出 678 个差异表达基因，其中包括 ALP1、TGF1 ( transforming growth factor 1 )、OCN ( osteocalcin )、DLX5( distal-less homeobox 5 )、Axin2 ( axis inhibition protein 2 )、BMP2、IBSP ( integrin-binding sialoprotein )、MMP13( matrix metalloproteinases ) 等与成骨分化相关的基因，证明了辛伐他汀能够促进体外诱导培养的 BMSCs 向成骨细胞分化，其作用机制可能与调控多种成骨相关基因的表达有关。Pagkalos 等[10]首次报道了辛伐他汀在缺少成骨诱导培养基的条件下，诱导胚胎干细胞分化为成骨细胞，提高 OCN 和成骨转录因子 Osx ( osetrix ) mRNA 的表达，增强矿化作用。Liu 等[11]用不同浓度的辛伐他汀 ( 1～100 nm ) 干预牙槽骨成骨细胞 ( alveolar osteoblasts，AOBs )和牙周膜细胞 ( periodontal ligament cells，PDLs ) 发现，浓度为 1 nm 和 100 nm 浓度的辛伐他汀能够分别增加 AOBs 和PDLs 的 ALP 活性，辛伐他汀还可提高这两种细胞中 OPG( osteopontin )、和 OCN mRNA 的表达水平，从而促进骨形成。以上实验说明，在离体培养的多种成骨细胞前体细胞中给予辛伐他汀可促进成骨细胞特异性标志物表达水平的增高，起到促进成骨分化的作用。

三、作用机制

在体内、外研究中发现，他汀类药物的应用均有成骨细胞特异性标志物表达水平的增高；除此之外，多种细胞信号通路都参与调控成骨分化过程。Mundy 等[1]发现辛伐他汀可以通过抑制降低破骨细胞特异性标记物抗酒石酸磷酸酶表达水平降低破骨细胞活性；Maeda 等[12]报道辛伐他汀通过诱导 BMP2、ALP mRNA 的表达，促进骨基质蛋白如 COL I、OCN、骨唾液蛋白 ( bone sialoprotein，BSP )等蛋白水平的上调，从而增强骨形成；Yamashita 等[13]发现辛伐他汀通过抑制 TNF-α ( tumor necrosis factor ) -Ras( receptor tyrosine kinase ) / Rho / MAPK ( mitogen-activated protein kinase ) 信号通路和促进 BMP-Smad ( drosophila mothers against decapentaplegic protein ) 信号通路，诱导BMPs 蛋白的表达从而刺激成骨分化；Chen 等[14]发现辛伐他汀能够提高成骨细胞活力，并通过 Ras / Smad / Erk /BMP-2 信号通路上调 BMP2、ALP、BSP 和 COL I mRNA表达，正性调节成骨细胞代谢，刺激成骨分化；辛伐他汀还能通过 ERK1 / 2、经典 Wnt ( wingless-type ) 通路，上调COL I、OCN、骨桥蛋白 ( osteopontin，OPN ) mRNA 的表达水平，促进胚胎干细胞、牙周膜细胞成骨分化[15-16]；Qiao等[16]在胚胎干细胞的培养过程中加入辛伐他汀，在培养后 7 天 ALP 活性明显增高，培养后 14 天矿化作用明显，同时上调 Runt 相关转录因子 2 ( runt-related transcription factor 2，Runx2 )、Osx、OCN mRNA 表达水平，OCN、OPN 和 COL I 蛋白表达水平；当阻断经典 Wnt 信号通路后，以上表现均下调，更加证明了经典 Wnt 信号通路参与了辛伐他汀成骨的作用调控过程；低剂量的辛伐他汀对成骨的增殖和分化也有促进的作用，这可能和其抑制了甲羟戊酸途径有关。亲脂性他汀类药物的短暂作用就足以启动成骨的级联反应，这可能与 BMP2 的激增有关[17]。Ghosh-Choudhury 等[18]用洛伐他汀刺激磷脂酰肌醇 3-激酶( phosphatidylinositol 3-Kinase，PI3K ) p58 调节亚单位的酪氨酸磷酸化，进而提升成骨细胞内激酶的活性；洛伐他汀还能迅速激活 Ras 从而活化质膜上的 PI3K，通过调节 ERK( extracellular-signal-regulated kinases ) 信号通路诱导 BMP2的表达，刺激成骨细胞分化。辛伐他汀和洛伐他汀都能够通过 ERK 信号通路促进牙周膜细胞 ALP 活性和增强基质矿化，刺激血管内皮生长因子，促进成骨分化[15,19]。

四、给药途径和剂量

由于肝脏代谢作用，辛伐他汀口服给药不能被很好地吸收，只有不到 5% 的口服剂量进入体循环[20]。药物在骨髓中的浓度尚不明确，以现有的口服给药方式，成骨细胞和破骨细胞在骨髓中接触的药物浓度是非常低的[21]。体内成功应用他汀类药物的保证是选用合适的缓释系统和给药剂量。良好的载体可以为新生骨塑性，抑制骨降解率。因此，选择能够避开肝脏首过消除作用的给药途径、载体以及合适的给药剂量，特别是寻找不同给药途径下达稳态血药浓度的最低给药剂量，已成为他汀类药物应用于临床治疗骨质疏松症的关键。

研究报道，将带有辛伐他汀涂层的钛植入物植入体内，其周围可观察到大量新生骨形成[22]。明胶海绵是一种生物相容性、生物吸收性和可塑性非常好的材料。研究发现，在 Wista 大鼠下颌骨直径为 3 mm 的骨缺损内填充浸有辛伐他汀的明胶海绵后，与对照组 ( 占有水的明胶海绵植入到骨缺损部位的大鼠 ) 相比有 240% 的新生骨形成[23]。Nyan 等[24]对比硫酸钙与含有 1 mg 辛伐他汀的硫酸钙对成骨的影响时发现，只有后者具有促进成骨的能力。下颌骨切牙拔出后，用含有 1 mg 辛伐他汀的聚乳酸 /聚乙醇酸复合物填充骨缺损，能够促进缺损处骨形成的速率[25]。这些载体的主要目的是定位并保持分子作用的部位、降低给药剂量并促使药物向细胞渗透，以促进细胞增殖和分化[20]。

王晶莹等[26]在直径为 10 mm 的颅骨全层极限缺损模型中，向缺损区植入含有辛伐他汀 20 mg 的聚乳酸40 mg，术后 8 周 X 线片显示，实验组 ( 缺损区植入辛伐他汀 20 mg，聚乳酸 40 mg ) 内动物大部分骨缺损区显示为不规则的高密度阴影，对照组 ( 缺损区单纯植入聚乳酸40 mg ) 内动物大部分缺损区域仍为低密度透光影；不脱钙骨组织切片甲苯胺蓝染色显示，术后 4 周实验组骨缺损区有少量新骨形成，术后 8 周实验组骨缺损区被大量骨组织充填。Mukozawa 等[27]在日本大白兔保留骨膜的直径为5 mm 的 5 处鼻骨骨缺损上，分别用 2.5 mg / ml 浓度的辛伐他汀水凝胶和端胶原海绵填充骨缺损，发现两种载体在给药后 2 和 4 周 BMP2 蛋白的表达明显增高，两种载体的效果无明显差异 (P＞0.05 )。静电纺丝可生物降解纤维是一种纳米或微米级高多孔性材料，可模拟自然细胞基质的环境，多用于骨组织工程学中作为药物载体，可使药物缓慢释放。Wadagaki 等[28]报道了静电纺丝可生物降解纤维缓释辛伐他汀的效果，发现给药后 1 天释放 5%，给药后 1～7 天一直保持稳定的释放速度，给药后 14 天大概释放 35%，给药后 28 天释放55%，且给药后 14 天辛伐他汀组促进成骨细胞分化和抑制破骨细胞分化的作用较对照组( 静电纺丝可生物降解纤维未加入辛伐他汀 ) 细胞明显增加，并能促进钙沉积。Yin 等[29]发现，大剂量 ( 10% ) 辛伐他汀的大孔钙磷酸盐骨水泥会引起降低抗压强度，诱发严重的肌肉坏死和炎性反应；而小剂量 ( 1% ) 的辛伐他汀大孔钙磷酸盐骨水泥对细胞理化性质和生物相容性没有影响，且能增强孔内的成骨潜力。

综上所述，体内外实验中均证实他汀类药物具有成骨分化潜能，主要通过促进 BMP2 的表达，进而提高成骨细胞的特异性标记物表达水平，从而发挥成骨作用。在此过程中，有多条信号通路参与调控，包括 MAPKs、Wnts 和BMP-Smad 等。体内局部给药可以在缺损部位短时间达到药物作用浓度，降低用药剂量，降低血药浓度，以减少不良反应。

[1] Mundy G, Garrett R, Harris S, et al. Stimulation of bone formation and in rodents by statins. Science, 1999, 286 (5446):1946-1949.

[2] Montagnani A, Gonnelli S, Cepollaro C, et al. Effect of simvastatin treatment on bone mineral density and bone turnover in hypercholesterolemic postmenopausal women: a 1-year longitudinal study. Bone, 2003, 32(4):427-433.

[3] Wang JW, Xu SW, Yang DS, et al. Locally applied simvastatin promotes fracture healing in ovariectomized rat. Osteoporos,2007, 18(12):1641-1650.

[4] Desager JP, Horsmans Y. Clinical pharmacokinetics of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitors.Clin Pharmacokinet, 1996, 31(5):348-371.

[5] Schachter M. Chemical, pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of statins: an update. Fundam Clin Pharmacol, 2005, 19(1):117-125.

[6] Wong RW1, Rabie AB. Statin-induced osteogenesis uses in orthodontics: a scientific review. World J Orthod, 2006,7(1):35-40.

[7] Ho ML, Chen YH, Liao HJ, et al. Simvastatin increases osteoblasts and osteogenic proteins in ovariectomized rats. Eur J Clin Invest, 2009, 39(4):296-303.

[8] 蔡羽中, 何爱咏, 王欣文, 等. 辛伐他汀与BMP2促进兔桡骨骨折愈合的对比观察研究. 生物医学工程与临床, 2011,15(1):10-14.

[9] 田发明, 张柳, 孟亚强, 等. 辛伐他汀促进大鼠BMSCs分化为成骨细胞. 基础医学与临床, 2010, 30(8):820-825.

[10] Pagkalos J, Cha JM, Kang Y, et al. Simvastatin induces osteogenic differentiation of murine embryonic stem cells.J Bone Miner Res, 2010, 25(11):2470-2478.

[11] Liu S, Bertl K, Sun H, et al. Effect of simvastatin on the osteogenetic behavior of alveolar osteoblasts and periodontal ligament cells. Hum Cell, 2012, 25(2):29-35.

[12] Maeda T, Matsunuma A, Kawane T, et al. Simvastatin promotes osteoblast differentiation and mineralization in MC3T3-E1 cells. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 280(3):874-877.

[13] Yamashita M, Otsuka F, Mukai T, et al. Simvastatin antagonizes tumor necrosis factor-alpha inhibition of bone morphogenetic proteins-2-induced osteoblast differentiation by regulating Smad signaling and Ras/Rho-mitogen-activated protein kinase pathway. J Endocrinol, 2008, 196(3):601-613.

[14] Chen PY, Sun JS, Tsuang YH, et al. Simvastatin promotes osteoblast viability and differentiation via Ras/Smad/Erk/BMP-2 signaling pathway. Nutr Res, 2010, 30(3):191-199.

[15] Kim IS, Jeong BC, Kim OS, et al. Lactone form 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitors (statins)stimulate the osteoblastic differentiation of mouse periodontal ligament cells via the ERK pathway. J Periodontal Res, 2011,46(2):204-213.

[16] Qiao LJ, Kang KL, Heo JS. Simvastatin promotes osteogenic differentiation of mouse embryonic stem cells via canonical Wnt/β-catenin signaling. Mol Cells, 2011, 32(5):437-444.

[17] Yazawa H, Zimmermann B, Asami Y, et al. Simvastatin promotes cell metabolism, proliferation, and osteoblastic differentiation in human periodontal ligament cells.J Periodontol, 2005, 76(2):295-302.

[18] Ghosh-Choudhury N, Mandal CC, Choudhury GG. Statininduced ras activation integrates the phosphatidylinositol 3-kinase signal to akt and MAPK for bone morphogenetic protein-2 expression in osteoblast differentiation. J Biol Chem,2007, 282(7):4983-4993.

[19] Takenaka M, Hirade K, Tanabe K, et al. Simvastatin stimulates VEGF release via p44/p42 MAP kinase in vascular smooth muscle cells. Biochem Biophys Res Commun, 2003, 301(1):198-203.

[20] Park JB. The use of simvastatin in bone regeneration. Med Oral Patol Oral Cir Bucal, 2009, 14(9):e485-488.

[21] Gutierrez GE, Lalka D, Garrett IR, et al. Transdermal application of lovastatin to rats causes profound increases in bone formation and plasma concentrations. Osteoporos Int,2006, 17(7):1033-1042.

[22] Yoshinari M, Hayakawa T, Matsuzaka K, et al. Oxygen plasma surface modification enhances immobilization of simvastatin acid. Biomed Res, 2006, 27(1):29-36.

[23] Ozeç I, Kiliç E, Gümüş C, et al. Effect of local simvastatin application on mandibular defects. J Craniofac Surg, 2007,18(3):546-550.

[24] Nyan M, Sato D, Oda M, et al. Bone formation with the combination of simvastatin and calcium sulfate in critical-sized rat calvarial defect. J Pharmacol Sci, 2007, 104(4):384-386.

[25] Wu Z, Liu C, Zang G, et al. The effect of simvastatin on remodelling of the alveolar bone following tooth extraction. Int J Oral Maxillofac Surg, 2008, 37(2):170-176.

[26] 王晶莹, 宋泉生, 朱静琳, 等. 辛伐他汀复合聚乳酸修复颅骨极限缺损的实验研究. 中国微创外科杂志, 2009, 9(12):1148-1151.

[27] Mukozawa A, Ueki K, Marukawa K, et al. Bone healing of criticalsized nasal defects in rabbits by statins in two different carriers. Clin Oral Implants Res, 2011, 22(11):1327-1335.

[28] Wadagaki R, Mizuno D, Yamawaki-Ogata A, et al. Osteogenic induction of bone marrow-derived stromal cells on simvastatinreleasing, biodegradable, nano- to microscale fiber scaffolds.Ann Biomed Eng, 2011, 39(7):1872-1881.

[29] Yin H, Li YG, Si M, et al. Simvastatin-loaded macroporous calcium phosphate cement: Preparation, in vitro characterization, and evaluation of in vivo performance. J Biomed Mater Res A, 2012, 100(11):2991-3000.