三维打印技术在骨组织工程中的应用及进展

周怡　夏阳　章非敏

三维打印技术在骨组织工程中的应用及进展

周怡夏阳章非敏

组织工程；生物相容性材料；细胞因子类；计算机辅助设计；三维打印

创伤、炎症和肿瘤等病理性因素或先天因素导致的骨缺损的治疗，特别是大段骨缺损的治疗是临床上的难点之一。现有骨缺损治疗方法主要包括骨移植 （自体、同种异体和异种骨移植）、植入人工生物材料和牵张成骨等，但均不能取得满意的效果［1］。近年来，快速发展的骨组织工程技术为骨缺损的修复提供了一种新的方法。骨组织工程包括种子细胞、支架材料和细胞因子三个基本要素。支架材料作为骨组织工程的基础，其结构特征对骨缺损修复的最终效果具有非常重要的影响。随着影像技术、计算机辅助技术和材料工程的发展，三维打印技术开始应用于骨组织工程，给予制备生物学性能更佳的个性化骨组织工程支架以新希望。

一、三维打印技术

三维打印技术 （three-dimensional bioprinting，3 D bioprinting）是根据计算机辅助设计 （computer aid design，CAD）模型，或计算机断层扫描 （computed tomog-raphy，CT）、磁共振成像 （magnetic resonance imaging，MRI）等数据重建的模型，使用计算机控制的打印系统进行三维打印，通过材料精确的分层堆积，快速制造任意复杂形状三维物体的数字化成型技术［2-3］，包括选择性激光烧结 （selective laser sintering，SLS）、熔融沉积成型 （fused deposition modeling，FDM）、光固化成型 （stereolithography appearance，SLA）和金属直接熔融等多种技术。三维打印技术已逐步应用于航天、军工、医疗和建筑等各个领域，并且随着新材料的发展，打印材料由金属、塑料等非生物材料发展到凝胶、细胞等生物材料，以及最近的 DNA 水凝胶材料。由于三维打印技术具有精度高、速度快和可定制等优点，越来越多地运用到生物医学领域。

在医学影像技术和数字化医学的辅助下，三维打印的疾病模型为医生提供了更全面、更直观的信息，便于医患之间的交流。临床医生甚至可以利用模型进行模拟手术，以制订更优的手术方案，从而缩短手术时间，提高手术成功率，降低术后并发症的发生几率［4-8］。此外，运用三维打印模具间接制作的个性化假体已用于临床。王臻等［9］通过 CT 扫描获得患者的股骨髁数据，进行矢量化三维重建并在计算机辅助下设计人工关节面，三维打印完成光敏树脂原型后翻制阴模，铸造获得个性化钛合金关节，植入患者体内后随访 16 个月，膝关节功能良好。可见，借助三维打印模型制造个性化金属植入物方法可行，但流程比较繁琐。逐渐成熟的金属三维打印技术可以直接制造金属植入物作为骨替代物修复骨缺损。已有研究利用 SLS 技术打印镍钛合金多孔支架，体外细胞实验证实其具有良好的生物相容性［10］。直接打印的金属植入物应用于人体的研究尚处于初期。2012 年比利时 Hasselt 大学 BIOMED 研究所［11］基于三维图像数据使用 SLS 法将纯钛超细粉末熔融成型制备了人工下颌骨，成功实施了世界首例三维打印人工下颌骨置换术，手术的远期效果尚待评估。

三维打印应用于骨组织工程，以生物材料或活细胞或生物材料与活细胞同时进行打印，是三维生物打印技术应用的一个方面。三维生物打印技术一般采用喷墨打印、微挤压成型和激光辅助三种方法，其中最常用的是喷墨打印技术［12］。生物三维打印技术尚处于起步阶段，其主要挑战是研究与生物材料相容的打印方法以及研发同时满足机械和生物性能要求的新材料，最终实现复杂三维生物结构的构建，如个性化植入体、组织工程骨、人工器官和体外仿生模型等。

二、骨组织工程

骨组织工程主要是研制骨替代物即组织工程骨来修复骨缺损，其基本原理是在体外构建支架材料-种子细胞-细胞因子的复合物，然后移植到骨缺损区，通过支架的降解和新骨的形成，以新生骨组织替代支架材料，从而修复缺损骨的形态和功能［13］。在骨组织工程中，支架作为一个暂时的、人工的细胞外基质起到促进新骨形成的作用［14］。其主要功能是为种子细胞提供合适的场所、促使其发挥生物学效应。它作为组织工程骨再生的框架，直接影响细胞的增殖和分化，是骨组织工程中的关键要素［15］。理想的支架应具有仿生的梯度结构 （梯度功能材料）、孔隙率高且孔径适宜、机械强度和降解速度与组织匹配以及良好的生物相容性和骨诱导活性［16］。主要评价因素如下［17］：孔径大小、孔隙率、孔道连通程度及扭曲度、孔分布的均匀性和支架的比表面积等。而支架的构建以往多采用单纯的铸造技术，须借助于阴模翻制出各种形状，通过粒子浸出法、冷冻干燥法等方法获得支架内孔隙［18］，无法控制材料的孔隙大小和相互贯通性，也无法定制支架的外形。

三、三维打印技术与骨组织工程

三维打印技术借助影像学手段获得骨缺损的数据，计算机辅助设计出待建的三维结构，选用合适的材料，采用三维打印构建骨组织支架。与传统方法相比其具有极大的优势［19］：自动化制造，过程简化、速度加快，具有可控性和可重复性；不依赖于特殊模具，打印的支架可以根据患者骨缺损的大小和形状“量身定制”；可以构建复杂的内部结构，获得合适的孔隙率和孔径；不同的细胞、细胞因子甚至基因都可以同步打印到支架的特点部位。

1. 三维打印生物材料：应用于骨组织工程中的打印材料需具备足够的机械强度与成骨能力，具有合适的降解速率以配合骨组织的构建，一般可分为人工合成和天然材料两大类。人工合成材料有聚乳酸 （polylactic acid，PLA）、聚羟基乙酸 （polyglycolic acid，PGA）及其共聚物 （polylactide-glycolide acid，PLGA）、聚己内酯 （polycaprolactone，PCL）、羟基磷灰石 （hydroxyapatite，HA）、磷酸三钙 （tricalcium phosphate，TCP）等。天然材料包括胶原、纤维蛋白、壳聚糖、藻酸盐等。人工合成和天然材料各有优缺点［20-21］。人工合成材料的机械性能较好，但生物学性能欠佳；天然材料需解决抗原性和机械性能差的问题。目前，尚无完全满足要求的理想支架材料，一般采用两种或两种以上材料复合的方法来弥补单一材料的缺陷。

PLA、PGA 和 PLGA 是目前应用较广泛的几种合成高分子支架材料，生物相容性较好，降解产物无毒，可通过体内代谢排除。PLGA 的降解速率可通过改变 PLA、PGA的比例来调控。但是这类材料存在缺点，如亲水性差、机械强度不足、酸性代谢产物对细胞生长不利等［15］。近年来对 PLGA 的应用有广泛的研究。Xu 等［16］采用低温沉积，将热致相分离与三维打印技术结合，制备出一种天然珍珠 / PLGA 的复合三维支架，具有高的孔隙率 （81.98± 3.75）%，合适的孔径 ［ 大孔径 （495±54）µm，微孔径＜10 µm ］ 和机械性能 ［ 抗压强度 （0.81±0.04）mPa，弹性模量 （23.14±0.75）mPa ］，接种骨髓干细胞于其上进行培养，细胞获得良好的增殖与分化，证明其具有较好的生物相容性及骨诱导活性，能满足骨组织工程支架的要求。

羟基磷灰石具有生物相容性好、硬度大的特点，可用于承重部位，但是也有脆性大、不易塑型和难降解等不足［21］。Leukers 等［22］打印出羟基磷灰石三维支架，小鼠胚胎成骨细胞可在其上良好增殖，对羟基磷灰石支架在骨缺损修复中的应用具有重要意义。

胶原是一种天然蛋白质，具有优越的生物相容性和可降解性，广泛应用于骨组织工程支架材料。但其单独应用时强度较差，不能满足骨组织工程修复材料的要求，因而常用于复合支架的制备中，以增强材料的生物学性能。Chen 等［23］在 PLGA 支架的三维空隙中构筑胶原纤维，提高了 PLGA 材料的亲水性。Lee 等［24］采用聚己内酯和羟基磷灰石混合材料，打印制备骨-软骨支架，并在支架的关节面灌注 TGF-β3 和胶原，植入兔体内，获得良好的修复效果，并且动物的运动和承重功能基本正常。Inzana等［25］利用磷酸钙和胶原的混合物打印网状支架三维骨模型，植入小鼠股骨缺损处，术后可见植入物具有良好的机械性能、生物相容性及可降解性，并具有引导新骨形成的作用。

直接打印骨支架对材料有较严格地要求，因此，Lee等［26］采用一种间接打印的方法，先用明胶颗粒按所需外形打印出支架的模型，再将材料浇铸入模型，在空腔内制作出最终的支架。这种方法对材料的选择更为宽松，可用于制造复杂支架。

可用于支架打印的材料种类虽多，但单一材料在骨缺损的修复中各有优缺点，复合支架材料更具优势。且还有许多难题，如如何形成材料-细胞的理想界面，如何使材料的机械强度与降解速度的协调匹配，如何确保材料无致畸性、致癌性等［20］。不同打印技术对材料的要求不同，因此需要改进打印技术使打印工艺与材料更相容，在打印后仍保持材料的生物相容性、避免成型产品发生变形等，这些都是三维打印技术在制备骨组织支架时面临的挑战。以上问题的成功解决将使骨组织支架的性能越来越完善，能够更好地应用于临床。

2. 同步打印细胞和细胞因子：构建组织工程骨的方法以往是在预先制备好的支架上接种成骨类细胞，细胞在生物支架上体外培养后移植到患者体内，随着支架的降解以及细胞的增殖、分化，最终形成新的骨组织并替代支架材料。这种方法构建的简单支架已取得了一定的进展，但细胞只是简单的随机吸附于支架上，并不适宜构建复杂的骨组织支架［27］。三维生物打印技术可将不同的细胞堆积在支架的指定位置，并提供支撑基质，还可以通过添加细胞因子来调控细胞的生物学行为，实现支架材料、细胞和细胞因子三要素的同步控制［28］。

近年来在细胞打印方面已取得一定的进展。Hao 等［29］将兔间充质干细胞包裹于 I 型胶原中与 PLGA-β-TCP 材料复合，采用低温沉积制备三维支架修复兔桡骨缺损，取得了良好的修复效果。Xu 等［30］采用静电纺丝技术制备聚己内酯纤维薄膜，然后应用喷墨打印技术将含有兔弹性软骨细胞和胶原蛋白的水凝胶循环交替打印在薄膜表面，制备了具有良好生物学性能和机械性能的组织工程软骨。Gao等［31］将聚乙二醇二甲基丙烯酸酯与具有生物活性的纳米粒子混合，并加入人间充质干细胞采用喷墨打印的方法制备了三维支架，细胞培养后 21 天检测发现胶原及碱性磷酸酶的表达均增高，说明具有较好的成骨能力。

细胞活性因子是骨组织工程的三大要素之一，能影响细胞的生物学行为如细胞募集、增殖和分化等。当前骨组织工程的研究重点之一是构建模拟人体微环境的支架材料，作为细胞外基质为种子细胞提供良好的环境，并促进骨组织的再生，在支架材料上修饰细胞活性因子就是方法之一［32］。有研究将生物活性因子复合到打印完成的骨组织支架上构成活性人工骨，植入动物体内修复骨缺损［33］。但是采用三维打印同步装配细胞因子更具优势，它可以同时打印不同组分，并且配比精确，有利于构建更接近人体微环境的复杂三维结构。目前常用于骨组织工程的细胞因子有骨形态发生蛋白 （bone morphogenetic protein，BMP）、血管内皮生长因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）、血小板源生长因子 （platelet-derived growth factor，PDGF）、纤维母细胞生长因子 （fibroblast growth factor，FGF）、胰岛素生长因子 （insulin-like growth factor，IGF）、转化生长因子 （transforming growth factor beta，TGF-β）等［34］，其中常用于三维生物打印的有 BMP、FGF、IGF 等［35-39］。近年来有研究将细胞活性因子负载于生物材料上共同打印出骨组织支架，并进行细胞实验和动物实验，取得了初步成果。Poldervaart 等［36］将 BMP-2 负载于明胶微粒上，采用三维打印技术打印出水凝胶支架，发现 BMP-2 能够在 3 周内持续释放，并促进间充质干细胞的增殖与骨向分化，将该支架植入小鼠或大鼠皮下可见显著的成骨表现。

由于生物大分子容易受到酸、碱、热等理化因素的影响而发生变性，所以要实现共同打印细胞、细胞因子及生物材料的目标，就要求打印过程中的温度、环境及所使用的交联剂等对细胞和细胞因子的活性没有影响，所以打印条件相对温和的喷墨打印技术的应用越来越多。在打印机的墨水盒内按需装入配比好的混合材料，选择不同的细胞、细胞因子和支架材料等组成“生物墨水”［14］。在打印过程中，细胞仅有 4 ℃～10 ℃ 的升温，存活率至少达90%，具有较好的细胞相容性，能在不损害细胞活性、不改变细胞基因型的同时实现细胞的微观分布［27，40］。Xu 等［41］成功地利用热发泡式喷墨打印机打印中国仓鼠卵巢细胞和胚胎运动神经元细胞，并保持其生物活性。Campbell 等［37］利用喷墨打印技术成功将活性 FGF-2 打印到纤维蛋白膜上。Cooper 等［35］采用喷墨打印技术将 BMP-2 混入三维多孔骨支架中，并证实 BMP-2 的存在有效地促进细胞分化和骨组织生成。这些都证明了利用三维打印技术在体外构建器官替代物甚至打印活器官的可行性。

三维生物打印技术尚处于起步阶段，还有许多问题需要解决，其中最主要的就是探索更好地保持细胞和细胞因子生物活性的方法。随着三维生物打印技术的不断发展，对细胞、细胞因子与生物材料共同打印技术的研究将不断深入，直接打印与正常骨组织结构、功能相仿的人工骨将成为可能，有望解决大段骨缺损治疗的难题。

四、总结与展望

三维打印技术在打印材料、细胞和细胞活性因子等方面已经取得了一定成果，三维打印支架也开始应用于骨组织工程，但大多处于体外试验和动物实验阶段。目前尚无产品化的打印支架用于骨组织工程，还有许多亟待解决的问题，如：如何获得生物学性能和机械学性能更佳的材料？如何调控材料的降解速度？如何实现细胞在支架内按照预制组织结构分布？如何构建营养通道等？这些都是未来研究的方向。三维打印的医疗器械需要制定相应的行业标准进行质量控制，以确保其使用的安全性。

总之，三维打印技术在骨组织工程中具有广泛地应用前景，但其未来发展的道路漫长而曲折，需要生命科学、材料学和工程学等多学科的整合和突破。

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（本文编辑：李贵存）

Applications and progress of three-dimensional printing technique in bone tissue engineering

ZHOU Yi， XIA Yang，ZHANG Fei-min. Jiangsu Key Laboratory of Oral Diseases， Nanjing Medical University， Nanjing， Jiangsu， 210029， PRC Corresponding author： XIA Yang， Email： xiayangxy@sina.com

Bone tissue engineering includes 3 basic factors： cells， scaffolds and cytokines. The fast developments of bone tissue engineering provide new approaches for better restoration and reconstuction. Among them， new methods to fabricate optimal personalized scaffolds by three-dimensional （3 D）bioprinting technique draw much attention. 3 D bioprinting is a branch of 3 D printing in biomedicine. It builds up a 3 D structure by printing with biomaterials and / or cells （cytokines）. As a novel technique in tissue engineering， 3 D bioprinting performs better than traditional techniques. It can fabricate personalized scaffolds with high porosity and proper pore size easily and rapidly， and the scaffolds can meet the requirement of biocompatibility and mechanical strength in tissue engineering. Moreover， cells or cytokines can be deposited into biomaterials during printing， which can make the scaffolds both osteoinductive and osteoconductive. Although 3 D bioprinting has already been applied， it is still at a preliminary stage and improvement is still in need. It is important to search for the suitable approach for the deposition of cells and cytokines， to explore the way to maintain the bioactivity， and to develop new biomaterials for 3 D biopringting. With the development of medical imaging， digital medicine and new biomaterials， 3 D bioprinting will be used more and more in bone tissue engineering.

Tissue engineering；Biocompatible materials；Cytokines；Computer-aided design；Bioprinting，three-dimensional

10.3969/j.issn.2095-252X.2015.11.010

R318

国家自然科学基金 （81400486）；江苏省自然科学基金 （BK20140911）；江苏省博士后基金 （1402044B）；中国博士后基金 （2015M571647）；江苏高校优势学科建设工程资助项目 （2014-37）

210029江苏，南京医科大学口腔疾病研究江苏省重点实验室

夏阳，Email： xiayangxy@sina.com；

2015-06-19）