基于HER2靶点的乳腺癌细胞多模态显像研究

付婷婷 尹胜男 朱静芬 程 亮 李勇刚

2 苏州大学功能纳米与软物质研究院

乳腺癌是临床上常见恶性肿瘤之一，其发病率位居大城市女性肿瘤的第一位，已成为对妇女健康威胁最大的疾病[1]。高表达HER2受体的乳腺癌恶性程度高、淋巴结转移早、术后易复发、预后极差[2]。因此，在体检测乳腺癌HER2受体表达水平，对于手术方案的制订、术后复发与残留灶的早期发现、预后评估均具有十分重要的临床意义。Trastuzuma是一种人源性IgG1单克隆抗体，能与HER2受体的膜外段高效、特异性结合，其亲合常数（Kd）为0.1nM，已应用于乳腺癌的临床靶向治疗[3-5]。本课题采用稀土上转换光学材料氟化钠钆（UCNP）纳米晶体标记Trastuzumab，构建基于UCL/MRI多模态显像的靶向纳米颗粒UCNPPEG-Trastuzumab，体外行细胞结合试验及UCL/MRI多模态显像,检测其结合效率。采用上转换光学成像、MRI T1加权成像（T1WI），探讨基于HER2靶点的多模态显像用于乳腺癌靶向诊断的可行性及价值。

方 法

1.材料

1.1 主要试剂：本实验所用稀土元素(Gd、Yb、Er)均为上海化学工业有限公司产品，有机溶剂(OA、ODE)、MTT及有机高分子（PEG）为Sigma-Aldrich公司产品，胎牛血清和DAPI为美国Invitrogen产品，细胞培养基购买于Thermo Scientific公司，SKBR3细胞由上海中科院细胞库提供。

1.2 主要仪器：酶标仪、共聚焦显微镜，3.0T MRI等。

2.UCNP的合成、表征与修饰

通过热分解法将稀土氧化物与三氟乙酸反应制得的三氟乙酸盐作为先驱体，加入到高沸点有机溶剂（OA、ODE体系)中，在惰性气体氮气保护下升温到320℃左右，使三氟乙酸盐热分解生成稀土氟化物NaGdF4（UCNP）。

通过透射电子显微镜(TEM)的表征，可以观察纳米微粒的形貌和粒子大小，径粒分布情。用电感耦合等离子体质谱技术（ICP）测得UCNP的浓度。

合成的UCNP材料表面为疏水基，通过聚合物包覆法用已合成的高分子C18PMH-PEG在氯仿中修饰UCNP，修饰后，UCNP-C18PMH-PEG（简称UCNPPEG）在水相中溶解度好。

3.UCNP-PEG与抗体连接，即UCNP-PEGTrastuzumab的制备

在pH=7.2～7.4的条件下，以EDC作为催化剂，用Sulfo-SMCC活化UCNP-PEG；用trant’s试剂、Herceptin抗体及EDTA溶液在pH=8的条件下完成抗体的巯基化偶联；将巯基化的抗体与活化的UCNP-PEG混合，反应24h，合成UCNP-PEG-Trastuzumab颗粒。

4.细胞毒性实验（MTT）

UCNP-PEG取9个浓度梯度，分别是400、200、100、50、25、12.5、6.3、3.2、1.6μg/ml，孵育24h后，加入MTT（5mg/ml），4h后除去培养基和材料混合物，加入DMSO，选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。

5.SKBR3细胞细胞标记后体外UCL/MRI成像

5.1 共聚焦显微镜成像（Confocal）：以1×105/ml的细胞浓度进行细胞接种并培养过夜，20μg/ml浓度的UCNP-PEG-Trastuzumab、UCNP-PEG与SKBR3细胞共孵育30min后，反复PBS冲洗未结合材料，加入4%甲醛固定细胞，DAPI染细胞核，反复PBS冲洗染液，进行共聚焦显微镜成像，激发光波长为980nm。

5.2 体外MRI成像：分别设置water（水）、untreated（纯SKBR3细胞）、UCNP（UCNP-PEG孵育细胞）及UCNP-Trastuzumab（UCNP-PEGTrastuzumab孵育细胞）四组，纯细胞作为空白组，加入20μg/ml浓度的非靶向探针UCNP-PEG的为对照组，加入20μg/ml浓度的UCNP-PEG-Trastuzumab的为实验组，材料与细胞孵育30min，均用PBS洗去未结合材料，然后四组样品均置于2ml EP管中，进行MRI成像并测量信号强度。

扫描条件：采用腕关节线圈，选择快速自旋回波序列进行T1WI扫描，扫描参数：TR 440ms，TE 149ms，视野60mm，层厚2mm，无间距扫描，矩阵256×192，采集次数4，翻转角90°。

结 果

1.UCNP的形貌与光学特性

透射电镜（TEM）显示其形态为球形，粒径约为60nm左右（图1）。高分子C18PMH-PEG修饰的UCNP在去水中具有很好的分散性，通过ICP测试浓度为1mg/ml，UCNP的上转换发射光谱，可以发现其发射光谱范围为500～700nm，峰值为540nm（图2）。溶于水的UCNP-PEG在980nm激发光下的样品，可见发出很强的绿色荧光（图3）。

2.UCNP-PEG对SKBR3细胞的毒性分析

UCNP-PEG与细胞共孵育24h后，其对细胞的毒性，结果显示实验浓度的UCNP-PEG对SKBR3细胞没有明显毒性（图4）。

3.SKBR3细胞细胞标记后体外UCL/MRI成像

结果

在Confocal成像中，实验组UCNP-PEGTrastuzumab处理的SKBR3细胞膜表面可见均匀分布的绿色荧光，细胞内无荧光，而对照组UCNP-PEG处理的SKBR3细胞则无此显像（图5），由此证明靶向探针UCNP-PEG-Trastuzumab可以与膜受体HER2特异性结合。

图1 UCNP投射电镜图像，UCNP为大小均匀的类圆形球状结构，大小为60nm。图2 UCNP的上转换发射光谱，其发射光谱范围为500～700nm，峰值为540nm。

图3 UCNP-PEG-Trastuzumab在可见光与980nm激发光下的图片。A.可见光下为透澄清的液体。B.980nm激发光下发出较亮的绿光。

图4 细胞毒性实验（MTT），在对照组不加材料，九组不同材料浓度下的细胞毒性，细胞存活率均在85%以上。图5 Confocal图像，实验组UCNP-PEG-Trastuzumab处理细胞周围可见均匀分布的环形绿色荧光，细胞内无荧光，而对照组UCNP处理细胞内外均无UCNP荧光。

四组样品经MRI 扫描示靶向探针UCNP-PEGTrastuzumab处理的HER2表达阳性的SKBR3细胞信号强度为510，呈明显短T1高信号；非靶向探针UCNPPEG处理的对照组细胞信号强度为360，呈T1稍高信号；空白组MR扫描信号强度为329，呈T1等信号；水信号强度为206，呈T1低信号（图6）。

图6 MRI T1加权像，water（水）、untreated（纯Sk-br-3细胞）、UCNP（UCNP-PEG孵育细胞）及UCNP-Trastuzumab（UCNP-PEGTrastuzumab孵育细胞）四组在MRI T1WI上信号强度分别为206、329、360、510，呈由暗到亮的梯度变化。

讨 论

乳腺癌是临床上常见的恶性肿瘤之一，并已成为对妇女健康威胁最大的疾病，根据2010年中国人口协会发布的《中国乳腺疾病调查报告》显示：我国城市地区乳腺癌的病死率增长了38.91%，发病率位居大城市女性肿瘤的第一位[1]。各型乳腺癌中，HER2受体高表达的乳腺癌恶性程度高、淋巴结转移早、术后易复发、预后极差[2]，本实验探索性的研究了对HER2受体高表达的乳腺癌细胞进行靶向成像的新技术，其对于该型乳腺癌手术方案的制订、术后复发与残留灶的早期发现、预后评估均具有十分重要的临床意义。

光学成像技术具有非电离、非接触、高灵敏度、高通量和低成本的优点，而且可以提供细胞或分子水平的信息，几乎是单分子敏感；但由于生物组织对可见光具有较强吸收和散射作用，导致可见光在生物组织中的穿透深度较浅和图像信噪比较差，并且在体内实验中，不能很好的显示组织解剖和生理细节。MRI在体内实验时，具有较好的空间分辨率、软组织分辨率和无辐射特点，可以提供充分的解剖信息，对乳腺癌的检查有独特的优势，由于缺乏分子水平成像能力和较低敏感性，对早期乳腺癌与转移病灶诊断困难[6]。

稀土上转换纳米粒子（UCNP），作为一种新型的光学材料，其具有独特的多光子激发特征，能在近红外光（980nm）的激发下发射出短波长的可见光（绿光），实现光子能量的上转换，因而具有更好的光学稳定性和近红外激发光的强组织穿透性[7-8]。UCNP中各稀土元素比例分别为Gd78%、Yb20%、Er2%，而UCNP中含有的稀土元素Gd对T1弛豫时间影响较大，可通过缩短氢质子的弛豫时间而影响组织的T1弛豫时间，所以作为MR成像的T1WI造影剂，UCNP成功的将光学成像与MRI相结合，可结合不同成像方法的优点，克服单种成像方式的不足，形成兼顾空间分辨率、成像深度、软组织分辨率、敏感性、细胞水平成像能力的探针技术，UCNP可用于多模态显像的研究[9]。乳腺癌分子靶向治疗药物Trastuzumab（曲妥珠单抗）能与HER2受体的膜外段高效、特异性结合[10-12]，最后用高分子C18PMHPEG修饰UCNP，使其具有水溶性，并提供氨基，为连接Trastuzumab提供桥梁，合成的UCNP-PEGTrastuzumab可以实现对HER2高表达人乳腺癌SKBR3细胞靶向标记与成像。

根据MTT实验以及UCNP成像特点，选择浓度为20μg/ml的UCNP-C18PEG-Trastuzumab进行实验，而Confocal成像和MRI成像均说明UCNP-PEGTrastuzumab对SKBR3细胞有特异性吸附，并说明可以对SKBR3细胞靶向成像。对比20μg/ml的UCNPPEG-Trastuzumab和UCNP-PEG对SKBR3细胞的靶向结合能力，经非靶向探针UCNP-PEG处理过的细胞T1WI呈稍高信号，可能是由于UCNP-PEG沉积在细胞间隙未能被PBS 彻底洗涤所致。

总之，UCNP-PEG融合了光学和核磁共振成像技术，再与Trastuzumab连接后，可以对HER2受体高表达的乳腺癌细胞行细胞靶向成像[13-15]。本实验强调了UCNP-PEG-Trastuzumab作为一种乳腺癌细胞成像特异性多功能探针的潜力，UCNP-PEG对SKBR3细胞毒性微小，由于在UCNP发射光谱范围内时，人体自发光背景干扰较小，用UCNP-PEG-Trastuzumab标记SKBR3细胞具有较高的敏感性，为进一步的活体实验提供基础，通过光学和MRI靶向成像为乳腺癌个体化治疗提供影像学依据。

此外，作为探索性研究，本实验未探讨探针浓度、成像时间及肿瘤HER2表达水平与光学、MRI信号之间相关性，需在后续实验中进一步深入研究课题。本课题组自行制备的多功能靶向探针具有良好的光学和磁学特性，体外细胞成像显示出针对乳腺癌HER2靶向成像效果，为下一步进行体内成像研究奠定了基础。

[1]徐雅莉,孙 强.乳腺癌高危因素.肿瘤防治研究,2010,37:1201-1205.

[2]Fehm T,Muller V,Aktas B,et al.HER2 status of circulating tumor cells in patients with metastatic breast cancer:a prospective,multicenter trial.Breast Cancer Res Treat,2010,124:403-412.

[3]Capala J,Bouchelouche K.Molecular imaging of HER2-positive breast cancer:a step toward an individualized ’imageand treat’strategy.Curr Opin Oncol,2010,22:559-566.

[4]Milenic DE,Wong KJ,Baidoo KE,et al.Targeting HER2:a report on the in vitro and in vivo pre-clinical data supporting trastuzumab as a radioimmunoconjugate for clinical trials.MAbs.2010,2:550-564.

[5]Cameron DA,Stein S.Drug insight:intracellular inhibitors of HER2--clinical development of lapatinib in breast cancer.Nat Clin Pract Oncol,2008,5:512-520.

[6]汪登斌,谭 令,江 浩,等.乳腺癌MRI研究.中国医学计算机成像杂志,2002,8:23-27.

[7]Cheng L,Yang K,Zhang S,et al.Multicolor in vivo Lymphatic Imaging Using PEGylated Up-conversion Nanoparticles.Nano Res,2010,3:722-732.

[8]Cheng L,Yang K,Zhang S,et al.Multicolor in vivo Imaging of Upconversion Nanoparticles with Emissions Tuned by Luminescence Resonance Energy Transfer.J.Phys.Chem.C,2011,115:2686-2692.

[9]Dev K.Chatterjee,Abdul J.Rufaihah,and Yong Zhang,Upconversion Fluorescence Imaging of Cells and Small Animals Using Lanthanide Doped Nanocrystals’,Bioma terials,2008,29:937-43.

[10]Tai W,Mahato R,Cheng K.The role of HER2 in cancer therapy and targeted drug delivery.J Control Release,2010,146:264-275.

[11]Nahta R,Yu D,Hung MC,et al.Mechanisms of disease:understanding resistance to HER2-targeted therapy in humanbreast cancer.Nat Clin Pract Oncol,2006,3:269-280.

[12]Shadidi M,Sioud M.Identification of novel carrier peptides forthe specific delivery of therapeutics into cancer cells.FASEB J,2003,17:256-258.

[13]Zhang W,Chen Y,Guo DJ,et al.The synthesis of aD-glucosamine contrast agent,Gd-DTPA-DG,and its application in cancer molecular imaging with MRI.Eur J Radiol,2011,79:369-374.

[14]Crich SG,Lanzardo S,Alberti D,et al.Magnetic resonance imaging detection of tumor cells by targeting low-density lipoprotein receptors with Gd-loaded low-density lipoprotein particles.Neoplasia,2007,9:1046-1056.

[15]Meng Q,Li Z.Molecular imaging probes for diagnosis and therapy evaluation of breast cancer.Int J Biomed Imaging,2013,2013:230487.