诱导多功能干细胞治疗缺血性卒中：诱惑与现实

刘宇恒，许治强，梁燕玲，李斯颖，林永强

缺血性卒中占全部卒中患者的60%～80%[1]。它严重影响并危害着人类的生命健康及生活质量，发病率和病死率每年都在增长[2]。目前，在临床上关于缺血性卒中的治疗方法较多，如抗凝、抗血小板聚集、改善微循环、改善脑代谢等，但这些方法对缺血区坏死的神经细胞不能产生再生与修复作用。血管内介入治疗则需要专业的操作，并承担一系列相关风险。而目前唯一能有效缩小病灶、改善功能损伤的药物是重组组织型纤溶酶原激活物（recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA），但其有效治疗时间窗为3～4.5 h[3]。中国国家卒中调查显示，静脉rt-PA溶栓治疗率为1.9%[4]。因此，寻找新的行之有效的方法来对缺血性卒中的急性期的治疗显得尤为迫切。

近年来，干细胞移植在促进血管形成、神经再生、分泌营养因子等方面，具有其他方法无法比拟的优势[5]。诱导多功能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）是干细胞中的一种特殊类型，它除了秉承干细胞治疗优点外，还克服了免疫原性、医学伦理方面的困难，在疾病建模、药物筛选等方面有一定潜力[6]。本文将对iPSC治疗缺血性卒中的研究现状、发展制约及未来展望展开综述。

2006年，Takahashi等[7]利用逆转录病毒，通过相应载体将Sox2、Oct3/4、Klf4和cMyc 4个因子整合到小鼠的成纤维细胞，获得了一类和干细胞特性类似的克隆细胞，命名为iPSC。2007年，又利用4种相同的转录因子将人的皮肤成纤维细胞诱导为iPSC[8]。

在缺血性卒中发生后，核心区和半暗带神经元相继发生坏死、凋亡。理论上，以合适的方式植入某种能分化为各种类型细胞的干细胞将是最根本的治疗措施。

目前已有大量的动物及临床研究证明干细胞移植可促进缺血部位脑组织和功能的恢复，保护神经并减少细胞凋亡[9-11]。骨髓间充质干细胞对新的神经元形成、保护和促进缺血性卒中大鼠的神经功能改善起着重要作用[12]。除了骨髓间充质干细胞外，神经干细胞和祖细胞可分泌相关因子并保护缺血区新生神经细胞，阻止疾病的进展[13]。这些干细胞修复神经损伤的机制可能包括细胞替代、营养神经、分泌相关因子、促发内源性血管再生、神经保护等[14]。但是iPSC治疗缺血性卒中的动物实验效果并不明朗。

将小鼠成纤维细胞来源的iPSC直接注射至大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）1 h的大鼠脑皮质损伤区后，iPSC能够很明显缩减梗死灶、改善抓握及旋转等运动功能，保护神经，及减少促炎性细胞因子释放[15]。Oki等[16]将人成纤维细胞来源的iPSC诱导分化为神经上皮干细胞移植到大鼠MCAO 48 h后的皮层区，这些神经干细胞能存活4个月以上，并能提高血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）水平和促进大鼠的感觉运动功能恢复。向小鼠MCAO的缺血区移植非特异性人iPSC来源的神经元前体细胞，能够促进相关神经细胞增长，显著改善神经缺损症状[17-20]。Wang等[21]分别将小鼠来源的iPSC和ESC移植到大鼠MCAO 90 min时的脑室中，7 d后发现两个实验组较对照组的神经功能评分有显著改善，而iPSC组和ESC组比较差异无显著性。免疫组化分析发现移植的干细胞能诱导成熟神经细胞及血管生成，且两组之间差异无显著性。或许在不久的将来，iPSC将能很好地替代ESC。

然而在一些动物实验中，却没得到预期的实验结果。Kawai等[22]将小鼠来源的iPSC移植到小鼠MCAO 24 h后的同侧纹状体和皮层，结果发现小鼠的行为学差异无显著性。Jensen等[23]先将人源iPSC体外分化成的神经干细胞（neural stem cell，NSCs），并在大鼠MCAO 7 d后植入皮层区。结果iPSC虽然有分化为神经元，但梗死灶体积并未缩小和神经功能的改善未达到预期效果。出现上述阴性实验结果的原因可能与iPSC过晚植入大鼠MCAO缺血区或者其他未知原因有关。尽管这些动物实验结果并未达到预期效果甚至为阴性结果，但是任有研究提示iPSC移植在缺血性卒中治疗中有积极作用，因此我们可以从不同的思路，从不同的角度展开iPSC的研究，以期出现稳定、可信的实验结果，如人和不同动物细胞来源的iPSC、不同诱导因子、病毒载体、iPSC生长环境、iPSC诱导形成的特定细胞、移植的部位、移植的时间，这些都是需要我们慎重考虑的问题，都将促使我们开展更多更完善的动物及进一步的临床试验。

虽然iPSC在治疗缺血性卒中方面蕴藏着巨大潜力，但是在基础研究及以后临床的实际运用中，仍然存在着一些困境，现对一些iPSC的自身不足和改进的方法做一介绍。

iPSC作为干细胞的一种特殊类型，存在诱导率低、致瘤性、单性遗传、免疫原性等难题，针对这些问题，不断有学者对其提供不同的解决方案。如Anokye-Danso用小鼠的微小RNA（micro RibonucleicAcid，miRNAs）诱导皮肤纤维细胞成功制备了iPSC，并将诱导转化率提高100倍以上[24]。也有研究提示应激引起的p38活化能增强iPSC的诱导率，在高渗条件下，能将Sox2、Oct3/4、Klf4和cMyc这4个因子的诱导效率提高10倍[25]。

在重编程制备iPSC的转录因子中，c-Myc和Klf4都属于癌基因，因此在转录过程中，这些癌基因有可能会被整合到受体基因组，引起基因突变，形成具有致癌性的iPSC[26]。L-Myc基因同样具有转录的作用，替代c-Myc后，可以最大程度减少iPSC成瘤性[27]。近年来iPSC另一重大技术突破是蛋白质诱导多能干细胞技术[28]。传统的基因诱导使用的是外源性遗传物质，它会对靶细胞的基因组产生影响，有致癌性。而蛋白质诱导多能干细胞技术则是直接向细胞导入蛋白质，不依赖转录因子，不会影响靶细胞的遗传物质，致瘤性这一问题可以得到有效解决，从而大幅度提高了安全性。但其研究费用高昂，技术比较复杂，目前尚处于研究阶段。

iPSC在具体功能上与ESC类似，具有分化的全能性，同时在技术层面避免了ESC所面对的一些伦理学问题和法律冲突。但是自身的iPSC完全有可能会分化为具有生殖能力的配子，因此迫使人类在运用iPSC时不得不面对单性遗传的伦理问题。

在iPSC的动物实验中，仍可检测到免疫反应的存在[29]。并非所有诱导多能干细胞及其衍生物都能激发免疫反应，诱导多能干细胞的免疫原性与胚胎干细胞仍有所区别，其差异性体现在细胞来源的不同及主要组织相容复合体（major histocompatibility complex，MHC）分子的不同[30]。iPSC在移植时仍需要关注免疫反应的存在。

iPSC从2006年问世至今，其技术不断成熟和完善。更多的研究给不同疾病治疗带来了新的曙光，同时iPSC技术在缺血性卒中治疗方面也显得日益成熟，有望在以后的临床中的得到实际应用。结合目前实际情况，从iPSC的安全性、可行性、高效性、便捷性等方面展开研究，可能给患者带来更多的治疗希望。

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【点睛】

本文重点介绍了iPSC治疗缺血性卒中的进展和不足，对基础和临床研究有一定的指导意义。