益气活血片的质量标准研究

卫向锋，牛春玲，袁倩倩，窦建卫，任翠翠＊（.西安中医脑病医院，西安 7003；.西安交通大学药学院，西安 7006）

益气活血片的质量标准研究

卫向锋1，牛春玲1，袁倩倩2，窦建卫2，任翠翠2＊（1.西安中医脑病医院，西安 710032；2.西安交通大学药学院，西安 710061）

目的 建立益气活血片的质量标准。方法 采用TLC法对制剂中的黄芪、当归、赤芍、川芎进行定性鉴别；采用高效液相色谱－蒸发光检测器法对黄芪甲苷进行了含量测定。结果 黄芪、当归、赤芍、川芎进行薄层鉴别具有较好的专属性；有效成分黄芪甲苷在0.538～26.9μg（r＝0.999 9）范围内呈现良好的线性关系，平均回收率为98.9%，RSD为1.8%（n＝6）。结论 所建立的标准可用于该制剂的质量控制。

益气活血片；TLC；质量标准；HPLC

益气活血片是西安中医脑病医院长期应用的医疗机构制剂，主要由黄芪、当归、赤芍、川芎、桃仁等组成，具有补气、活血、通络的功效，临床上用于治疗中风后遗症、半身不遂、偏身麻木、口眼歪斜、语言蹇涩、口角流涎等临床症状。为有效控制益气活血片的质量，本文制定了该复方制剂中黄芪、当归、赤芍、川芎的TLC（薄层色谱）鉴别方法及有效成分黄芪甲苷的高效液相色谱－蒸发光检测（HPLC－ELSD）的含量测定方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪（日本岛津LC－20A型）；PL－ELSD2100型蒸发光散射检测器；AB135－S0.01mg分析天平（梅特勒－托利多有限公司）。

1.2 试药 黄芪甲苷对照品（批号110781－200613）；芍药苷对照品（批号110736－201136）；阿魏酸对照品（批号110773－201012）；当归对照药材（批号120927－200512）；川芎对照药材（批号120918－201110），由中国药品生物制品检定所提供。益气活血片样品（0.3g／片；批号20130613，20130619，20130625）。

2 薄层色谱鉴别

2.1 黄芪的薄层鉴别 取益气活血片10片，先用乙醇溶液擦拭外表面除去糖衣，研钵研细；药片粉末用20mL甲醇加热回流1h，滤过，将滤液蒸干。残渣加水10mL使溶解，用水饱和过的正丁醇萃取3次，正丁醇体积分别为20，20和10mL，合并正丁醇萃取液；另取40mL 10g·L－1的氢氧化钠溶液洗涤2次，每次20mL；再用正丁醇饱和的水洗至中性，弃去洗液，蒸干正丁醇液，用1mL的甲醇溶解残渣，作为供试品溶液［1］。另按处方比例取不含黄芪的阴性对照药材，同法制成阴性对照溶液。取黄芪甲苷对照品（批号110781－200613）5mg，加5mL甲醇，溶解，制成对照品溶液。照《中国药典》（Ch.P 2010）薄层色谱法（附录VI B）实验，用毛细管吸取上述3种溶液各5μL点于同一薄层板（硅胶G）上，以体积比为13∶7∶2的三氯甲烷－甲醇－水［2］的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷100mL·L－1硫酸乙醇溶液，在105℃加热2min至斑点显色清晰。3批样品在日光与紫外灯365nm下，均具有黄芪甲苷的特征斑点，且阴性对照无干扰。

2.2 当归和川芎的薄层鉴别 取益气活血片10片，先用乙醇溶液擦拭外表面除去糖衣，研钵研细；加50mL 10g·L－1碳酸氢钠溶液，超声处理10min，离心后取上清液，用稀盐酸调pH值至2～3，用40mL乙醚分2次提取，每次20mL；提取完成后合并乙醚液，挥干乙醚液，用1mL的甲醇溶解残渣，作为供试品溶液。按处方比例取不含当归和川芎的阴性对照药材，同法制成双阴性对照溶液［3］。称取当归和川芎对照药材各3g，分别按照供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。再取阿魏酸对照品（批号110773－201012）5mg，加5mL甲醇，溶解制成对照品溶液。照《中国药典》（Ch.P 2010）薄层色谱法（附录VI B）实验，用毛细管吸取上述5种溶液各9μL，点于同一薄层板（硅胶G）上，用体积比为4∶1∶1∶0.1的环己烷－二氯甲烷－乙酸乙酯－甲酸为展开剂，展开，取出，晾干。3批样品在紫外灯365nm下，均具有阿魏酸、当归对照药材及川芎对照药材的特征斑点，且阴性对照无干扰。

2.3 赤芍的薄层鉴别 取益气活血片10片，先用乙醇溶液擦拭外表面除去糖衣，研钵研细；药片粉末用20mL乙醇［4］超声处理10min使溶解，滤过，滤液挥干。用1mL乙醇溶解残渣，作为供试品溶液。另按处方比例，取不含赤芍的阴性对照药材，同法制成阴性对照溶液。再取芍药苷对照品（批号110736－201136）10mg，加5mL乙醇，溶解制成对照品溶液。照《中国药典》（Ch.P 2010）薄层色谱法（附录VI B）实验，用毛细管吸取上述3种溶液各10μL，点于同一薄层板（硅胶G）上，以体积比为40∶5∶10∶0.2的三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷20g·L－1香草醛硫酸溶液，在105℃加热2min至斑点显色清晰［5］。3批样品在日光下，均具有芍药苷的特征斑点，且阴性对照无干扰。

3 含量测定

3.1 色谱条件 色谱柱Diamosil C18（250mm× 4.6mm，5μm）；乙腈－水（68∶32）为流动相；蒸发光散射检测器检测，蒸发光散射检测器漂移管温度为75℃；载气流速为2.0L·min－1；柱温为40℃。按黄芪甲苷峰计算，理论板数应不低于4 000。

3.2 对照品溶液的配制 精密称取黄芪甲苷对照品（批号110781－200613）5mg，加10mL甲醇溶解，即得对照品溶液。

3.3 供试品溶液的制备 取益气活血片30片，先用乙醇溶液擦拭外表面除去糖衣，研钵研细；称取药片粉末适量（约6g），精密称定。置于索氏提取器内，加40mL的甲醇冷浸过夜，再加甲醇至合适量加热回流4h，提取液回收甲醇，蒸干溶剂，残渣加三蒸水20mL，略微加热使溶解；再用水饱和过的正丁醇提取5次，体积分别为20，20，20，20和15mL，最后合并正丁醇提取液；再用氨试液洗涤4次，体积分别为25，20，20和20mL［6－7］，弃去氨洗液，再蒸干正丁醇液，残渣用10～20mL热水溶解，放冷至室温。通过D101型（内径1.5cm，长12cm）大孔吸附树脂柱，用50mL蒸馏水洗脱，弃去水液；再用30mL体积分数40%的乙醇洗脱，弃去乙醇洗脱液；继用70mL体积分数70%的乙醇洗脱，洗脱液收集于蒸发皿内。水浴挥干洗脱液，残渣用适量甲醇溶解后转移到5mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度；摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

3.4 阴性对照品溶液的制备 取按处方除去黄芪的阴性样品适量，按照3.3项下的制备方法制成阴性样品溶液。

3.5 干扰性实验 精密吸取益气活血片的对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液各20μL进样，检测结果见图1。结果阴性样品在黄芩甲苷位置上未检出色谱峰，表明处方中其他成分对黄芪甲苷的测定不会产生干扰，该方法具有专属性。

图1 高效液相色谱图A.对照品；B.供试品；C.阴性对照品；1.黄芪甲苷Fig.1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.sample；C.negative sample；1.astragaloside A

3.6 线性关系考察 精密称取黄芪甲苷对照品（批号110781－200613），加甲醇制成质量浓度为1.36 mg·mL－1的溶液，作为黄芪甲苷储备溶液。精密量取储备溶液适量，加甲醇稀释制成黄芪甲苷质量浓度分别为0.026 9，0.053 8，0.107 6，0.161 4，0.215 2，0.269 0，0.322 8，0.376 6，0.430 4，0.484 2，0.538 0，0.807 0，1.076 0和1.345 0mg·mL－1的溶液，将以上溶液分别进样20μL，测定峰面积。以峰面积（Y）对进样量（X）进行线性回归，得黄芩甲苷的回归方程：Y＝1.417 8X＋4.749 8，相关系数r＝0.999 9。表明黄芪甲苷在0.538～26.9μg之间有良好的线性关系。

3.7 稳定性实验 精密吸取供试品溶液（批号20130613）10μL，分别于0，1，2，4，6和8h进样，测定黄芩甲苷的峰面积。结果对照品溶液的RSD为0.89%（n＝6），供试品溶液的RSD为1.33%（n＝6）。表明对照品溶液和供试品溶液在8h内稳定性良好。3.8 重复性实验 取益气活血片（批号为20130613）的样品，共6份，按照3.3项下的方法制备供试品溶液，分别精密取供试品溶液20μL及对照品溶液10和20μL进样，测定，按外标两点法对数方程计算样品中黄芪甲苷的含量。结果，有效成分黄芪甲苷的平均含量为0.21mg·g－1，RSD为1.9%，表明该方法重复性良好。

3.9 加样回收率实验 取益气活血片（批号为20130613）样品数片，除去糖衣，研细，取6份，精密称定，分别加入黄芪甲苷对照品溶液适量，搅拌均匀，氮气吹干，按3.3项下制成供试品溶液。按上述色谱条件及测定方法进行加样回收率的测定，结果见表1。

表1 黄芪甲苷加样回收率实验结果Tab.1 Result of recovery of astragaloside A （n＝6）

3.10 样品的含量测定 取3批（批号20130613，20130619，20130625）不同批次的益气活血片样品，采用上述色谱条件进行测定，结果3批样品中黄芪甲苷的平均含量为0.20mg·g－1。

4 讨论

对制剂中当归和川芎薄层鉴别时，由于当归和川芎都含有相同成分阿魏酸，在多种展开系统下，对照药材色谱在相同位置均显示相同斑点。因此，为了避免当归和川芎阴性样品的干扰，当归和川芎的薄层鉴别需增加双阴性对照，即用同时除去当归和川芎的药材做阴性对照，结果薄层效果良好。此外，益气活血片中的黄芪、赤芍的薄层鉴别结果斑点集中，显色清晰。本实验建立了益气活血片中有效成分黄芪甲苷的含量测定方法，并对方法学考察验证。结果表明，HPLC－ELSD测定黄芪甲苷方法简单、快捷、重复性好，可作为益气活血片质量控制的依据。

［1］ 李芳，王静怡，林海，等.养心开郁片质量标准研究［J］.西北药学杂志，2013，28（5）：469－471.

［2］ 张凤瑞，周贤，刘炎，等.当归补血汤中黄芪的鉴别及黄芪甲苷的含量测定［J］.吉林中医药，2013，33（3）：289－291.

［3］ 杨静.清心牛黄片质量标准的研究［J］.中国药师，2013，16（11）：1656－1659.

［4］ 徐晓弘，熊鑫.薄层色谱法鉴别活血通脉片研究［J］.中国医药导报，2011，8（5）：38－40.

［5］ 国家药典委员会.中国药典2010年版［S］.一部.北京：中国医药科技出版社，2010：283.

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［7］ 李文韬，史国兵，孙学惠，等.复方参芪五味咀嚼片的质量标准研究［J］.安徽农业科学，2011，39（11）：6389－6391.

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Study on quality standard of Yiqihuoxue Tablets

WEI Xiangfeng1，NIU Chunling1，YUAN Qianqian2，DOU Jianwei2，REN Cuicui2＊（1.Xi′an TCM Brain Disease Hospital，Xi′an 710032，China；2.School of Pharmacy，Xi′an Jiaotong University，Xi′an 710061，China）

Objective To establish the quality standard for Yiqihuoxue Tablets.Methods Astragali Radix，Angelicae sinensis Radix，Paeoniae Radix Rubra and Chuanxiong Rhizomain the prescription were identified by TLC.HPLC－ELSD was adopted for the quantative analysis of astragaloside A which is an effective component of the formula.Results The TLC of Astragalus Radix，Angelicae sinensis Radix，Paeoniae Radix Rubra and Chuanxiong Rhizoma showed good specificity.Astragaloside A showed good linearity over the range of 0.538－26.9μg（r＝0.999 9）and the average recovery was 98.9%，RSD＝1.8%（n＝6）.Conclusion The method can be used for the preparation quality control.

Yiqihuoxue Tablets；TLC；quality standard；HPLC

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.02.008

R917

A

1004－2407（2015）02－0131－03

2014－07－01）

2013年陕西省中医药管理局科研项目（编号：LC008）

卫向锋，男，中药士

＊通信作者：任翠翠，女，在读硕士研究生