金樱子总黄酮抗氧化及清除自由基的作用研究

苏上贵 ，韦玉兰，黄燕军 ，黄勇奇 ，罗广秀

（1.广西医科大学，广西 南宁 530021；2.广西中医药大学，广西 南宁 530001）

植物黄酮类化合物具有降血糖、降血脂、抗心律失常、抗氧化、增强机体免疫力、抗肿瘤等作用，近年来对植物黄酮的研究越来越受到关注。本课题组之前的研究发现，金樱子水醇萃取液在体内具有抗脂质氧化作用，并能调节TGF-β等相关基因的表达，从而达到治疗IgA肾病的功效［1-2］。总黄酮是金樱子的主要活性成分，尽管近年来金樱子的药用价值和食用价值正逐步得到开发，但有关金樱子总黄酮的药效及作用机制却鲜有报道。本文在已有的实验基础上，对金樱子总黄酮进行了提取，并初步观察了其抗氧化作用，结果报道如下。

1 实验材料

1.1 试药 金樱子，采集于湘桂交界处红土生长的成熟果实，自然晒干，粉粹，40目过筛。

1.2 仪器 722型可见分光光度计（上海第三方分析仪器厂制造）；菲恰尔系列离心机（上海菲恰尔分析仪器有限公司制造）；电热鼓风干燥箱（上海智城分析仪器制造有限公司）；旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）。

1.3 试剂 无水乙醇（分析纯）、苯酚（分析纯）、浓硫酸（分析纯）、乙醚（分析纯）、FeSO4（分析纯）、3%H2O2（分析纯）、0.15 mmol/L pH8.2的三羟甲基胺基甲烷（Tris）-HCl缓冲液、260 mmol/L邻苯三酚（分析纯）、浓盐酸（分析纯）、DPPH（分析纯）、0.2 mmol/L pH6.6磷酸盐缓冲液、1%铁氰化钾溶液、10%三氯乙酸溶液、0.1%三氯化铁溶液等。

2 方 法

2.1 金樱子总黄酮的提取 取成熟金樱子果实晒干，粉碎，过40目筛制成粉末。按1∶10的比例加入乙醚浸泡6 h脱脂，去乙醚，挥干，按质量体积比1∶10加入60%的乙醇60℃浸泡3 h，抽滤，取滤液，50~60℃减压蒸馏成糊状，冷冻干燥。总黄酮粉末用60%的乙醇溶解，4℃冷藏，备用。以芦丁为对照品，测定总黄酮含量。

2.2 金樱子总黄酮对·OH的清除作用 参照文献［3］方法并加以改进。取6支试管，依次编号为1~6号。分别加入5 mg/ml的金樱子总黄酮 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml，然后依次加入8 mmol/L FeSO40.5 ml，8 mmol/L 水杨酸 0.5 ml，加水 1 ml，以60%的乙醇补齐体积至3 ml，最后加入3%的H2O21 ml。摇匀，37℃水浴30 min，流水冷却至室温。用H2O作为空白调0（A0），于510nm处分别测定各管吸光度As。对照试验：用1.0ml蒸馏水取代H2O2溶液，其他步骤如上操作，测吸光度Ac，则样品对·OH 的清除率为：·OH 清除率（%）=［A0-（As-Ac）］/A0×100%。

2.3 金樱子总黄酮对O2-·的清除作用 参照文献［3］，取6支试管，分别编号为1~6号，分别加入1 mg/ml的金樱子总黄酮0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml，然后加入 pH8.0 的 Tris-HCl 3.0 ml，用60%的乙醇定容至4 ml，37℃预热5 min，加预热好的邻苯三酚0.5 ml，37℃反应10 min，加浓盐酸0.5 ml终止反应，用H2O作为空白调0，于320 nm处测定各管吸光度As。对照试验：用0.5 ml蒸馏水取代邻苯三酚溶液，其他步骤如上操作，测吸光度 Ac，则样品对O2-·的清除率为：O2-·清除率（%）=［A0-（As-Ac）］/A0×100%。

2.4 金樱子总黄酮总还原能力的测定 分别于6个试管中加入不同体积1 mg/ml的金樱子总黄酮溶液0，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 ml，并用水补齐至1 ml，然后加入0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH=6.6）2.5 ml和1%的铁氰化钾溶液2.5 ml，混合，50℃水浴保温20 min，加入2.5 ml 10%（w/v）三氯乙酸，混匀后3 500 r/min离心5 min，精密吸取上清液2.5 ml，加入2.5 ml蒸馏水和0.5 ml 0.1%的三氯化铁溶液，以蒸馏水为空白，在700 nm处测定各管吸光度。吸光度越大表示还原能力越强。

2.5 数据分析 采用SPSS13.0统计分析软件，计量数据以均数±标准差（±s）表示。组间差异采用 t检验，P ＜0.05为有显著性差异。

3 结 果

3.1 金樱子总黄酮含量 以芦丁为对照品，采用NaOH-Al（NO2）3比色法绘制标准曲线，结果见图1。得到金樱子总黄酮标准曲线的回归方程为：Y=10.318X+0.0054。X为芦丁的浓度，Y为510 nm处的吸光度值。根据样品吸光度和标准曲线，计算出样品金樱子总黄酮的含量为27.48%。

图1 芦丁对照品的标准曲线

3.2 金樱子总黄酮对羟自由基的清除作用 见表1。

表1 不同浓度金樱子总黄酮对·OH的清除作用 （±s）

表1 不同浓度金樱子总黄酮对·OH的清除作用 （±s）

金樱子总黄酮（mg/ml） 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 A510 1.509±0.000 1.413±0.000 1.419±0.000 1.337±0.000 1.139±0.000清除率（%） 7.84 23.69 30.67 47.31 69.73

从表1可看出，金樱子总黄酮对·OH自由基有较强的清除作用，并随浓度的增加而明显增加，当浓度达1.25 mg/ml时，金樱子总黄酮对·OH的清除率达69.73%。

3.3 金樱子总黄酮对O2-·的清除作用 见表2。

表2 不同浓度金樱子总黄酮对O2-·的清除作用 （±s）

表2 不同浓度金樱子总黄酮对O2-·的清除作用 （±s）

金樱子总黄酮（mg/ml） 0.04 0.08 0.12 0.16 0.20 A320 2.416±0.028 2.388±0.012 2.408±0.021 2.335±0.013 2.297±0.016清除率（%） 38.87 45.38 50.39 60.07 67.09

邻苯三酚在碱性条件下会发生自氧化，生产中间产物和超氧阴离子，其产物在320 nm处有特征吸收。表2显示，反应体系中加入金樱子总黄酮，O2-·可被迅速清除，并随着金樱子总黄酮浓度的升高，在去除色素背景的影响下，吸光度值降低，说明其对O2-·的清除作用增加。在浓度仅为0.04 mg/ml时，金樱子总黄酮对O2-·的清除率可达38.87%；当浓度为0.12 mg/ml时清除率达50.39%。

3.4 金樱子总黄酮的总还原能力 见表3。

表3 金樱子总黄酮的总还原能力 （±s）

表3 金樱子总黄酮的总还原能力 （±s）

金樱子黄酮（mg/ml） 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 A700 0.576±0.011 0.856±0.036 1.186±0.034 1.462±0.035 1.625±0.053

吸光度值的高低代表总还原能力的大小。由表3可以看出，随着金樱子总黄酮浓度的升高，其还原能力增加，两者呈正相关性。

4 讨 论

羟基自由基和超氧阴离子自由基的化学性质特别活泼，也是毒性最大的自由基，是造成组织脂质过氧化、蛋白质解聚与聚合、核酸断裂、多糖解聚的重要活性氧，羟基自由基清除率是反映其抗氧化作用的重要指标。据闵运江等［4］研究结果表明，在一定浓度范围内，金樱子黄酮类化合物用量越大，其抗氧化性越强，本研究结果显示，无论是对羟基自由基还是超氧自由基的清除作用，以及总的还原能力，结果都与相关的研究结果一致。但对不同的自由基，金樱子总黄酮的敏感性不尽相同。从上述结果看，金樱子总黄酮对超氧自由基的清除作用比较敏感，对羟自由基的清除作用相对弱一些。

本课题组在之前的研究中发现，金樱子水-醇萃取液在体内具有抗脂质氧化作用［2］。结合本研究结果，我们推测金樱子总黄酮可能是金樱子在体内抗氧化作用的重要成分。

［1］曾日海，黄艳明，韦玉兰，等.金樱子对大鼠肝组织脂质抗氧化作用的体外实验［J］.广西医科大学学报，2007，24（6）：68-70.

［2］韦玉兰，黄艳明，王坤，等.金樱子对IgA肾病大鼠肾脏组织 TGF- β 基因表达的影响［J］.陕西中医，2007，28（11）：1566-1568.

［3］王志旺，张扬，程芳，等.五脉绿绒蒿总黄酮及其中苜蓿素的体外抗氧化活性［J］.中国老年学杂志，2011，31（22）：4381-4383.

［4］闵运江，刘文中，陈乃富.皖西大别山区金樱子野生资源储备量的调查研究［J］.生物学杂志，2001，18（2）：26-28.