Exendin-4 对游离脂肪酸诱导肝细胞sirt6 表达及其对糖异生作用的影响

肖元元 王倩倩 毛月芹 魏美林 韩峻峰 殷 峻 魏 丽

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是一种由多病因引起的肝细胞内脂质蓄积过多所导致的临床综合征，它除了可以引起相关肝脏疾病如肝硬化、肝癌等疾病的发生以外，还与肥胖、血脂紊乱、2 型糖尿病、高血压等代谢综合征密切相关［1］。肝内过量的游离脂肪酸(FFA)及其异常代谢产物的过度堆积是造成肝细胞过度脂性凋亡，进而导致NAFLD 的主要原因［2］。Exendin-4 是胰高血糖素样肽1(GLP -1)受体激动剂，是一类目前广泛用于糖尿病治疗的新型药物，因其降糖效果显著，可明显降低体重，并且低血糖发生率较低而在糖尿病及肥胖症的临床治疗中得到应用［3］。除了对糖尿病有显著治疗效果以外，近年来的许多研究发现GLP -1 可以同样显著调节肝脏糖脂代谢。sirt6 是酵母染色质沉默因子(silent information regulator 2，sir2)同系物家族中的一员，近年来因其在基因的维护和修复、细胞存活和凋亡、炎症、心血管功能、氧化应激、寿命以及代谢和能量合成等方面所发挥的重要作用而受到越来越多的关注。研究发现sirt6 可以参与肝脏糖异生、糖酵解以及脂肪酸合成等关键步骤的调节［4］。关于肝脏脂质沉积是否会对sirt6 表达产生影响以及Exendin-4 是否可以通过sirt6 调节肝脏的糖脂代谢及其相关机制目前还不是很清楚。鉴于此，本课题旨在通过游离脂肪酸诱导肝细胞发生脂肪性病变模型，观察Exendin -4 对sirt6表达的影响以及其在肝脏糖异生作用中的调控机制。

材料与方法

1.材料:人肝癌HepG2 细胞株由上海市糖尿病研究所保存。棕榈酸、油酸、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma 公司。sirt6 Stealth RNAi 干扰质粒、对照干扰质粒、Lipo -fectamine2000 购自Invitrogen 公司。DMEM 培养液、胎牛血清购自Gibco 公司。兔抗sirt6 单克隆抗体购自Abcam 公司。兔抗β-actin 抗体购自CST 公司。辣根过氧化物酶标记的抗兔、抗小鼠二抗购自美国Promega 公司。ECL 化学发光反应试剂购自美国Millipore 公司。cDNA 反转录合成试剂盒购自TaKaRa 公司。MTT 试剂、BCA 蛋白测定试剂盒购自碧云天公司。

1.方法:(1)细胞培养:HepG2 细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM 培养液中，每2 天传代1 次。在37℃、95%湿度和5%CO2条件下进行常规培养。取对数生长期细胞接种于细胞培养板，待细胞生长至70% ～80%后，给予相应处理。对照组给予含1% BSA 的DMEM 培养，对照组分别给予300μmol/L 浓度的游离脂肪酸(棕榈酸与油酸比例为2∶1)与1%BSA 对待24h 后，再给予100nmol/L 浓度Exendin-4 对待24h。(2)油红O 染色:油红O 染料经异丙醇溶解后过滤，置于4℃备用。HepG2 细胞经过不同处理后弃培养液，PBS 洗3次，经10%多聚甲醛固定液固定后，加油红O 染液于细胞表面10min。用60%异丙醇洗细胞2 次，以去除多余的染料，自来水清洗，倒置显微镜下观察，拍照。(3)siRNA 干扰实验:将HepG2 细胞接种于6 孔板，在无抗生素的含10%胎牛血清的DMEM 培养基中培养24h，使其在转染时的转染密度约30% ～50%。将sirt6 stealth RNAi 和Stealth siRNA negative control 用Lipofectamine 2000 根据说明书转染HepG2 细胞。转染后48h，采用Western blot 法和RT -PCR 法检测Stealth RNAi 对sirt6 基因的沉默程度。(4)细胞RNA 的提取与RT -PCR:将接种于6 孔板内的HepG2 细胞按Trizol 说明书步骤提取总RNA，紫外分光光度计检测RNA 浓度，用RT-PCR 法扩增检测目的基因。目的基因引物设计见表1。反转录反应体系20μl，42℃温育50min，95℃加热5min，冰上放置终止反应。PCR 扩增采用20μl 反应体系。95℃预变性5min，95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸40s，经30 个循环，72℃延伸10min。PCR 产物用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳完毕后在紫外灯下照相。比较目的基因与内参基因β -actin 相对比值，计算表达水平。(5)Western blot 法实验:收集各组细胞，预冷PBS 洗细胞2 次。加入细胞裂解液，冰上裂解30min，4℃12000r/min 离心15min。取上清，此为细胞总蛋白，用BCA 法蛋白定量。将已定量好的细胞总蛋白与6 ×蛋白电泳上样缓冲液按5∶1比例混合。95℃水浴变性5min，冰上冷却备用。20～30μg 的蛋白经SDS -PAGE 电泳，再转移至硝酸纤维素膜上。转膜后用5%脱脂牛奶/TBST 封闭90min，分别用兔抗人sirt6、β-actin 等抗体，4℃孵育过夜。TBST 洗10min ×3 次。分别加HRP 标记的抗兔二抗室温孵育2h(1∶5000)。TBST 洗10min×3 次。用ECL 试剂进行显影曝光，扫描图像分析。

3.统计学方法:采用SPSS 19.0 软件进行数据分析，数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

表1 PCR 引物序列

结 果

1.游离脂肪酸诱导HepG2 细胞的脂肪酸沉积:分别用0 和300μmol/L 的游离脂肪酸对待HepG2 细胞24h 后，与对照组相比，300μmol/L 游离脂肪酸对待组细胞后，细胞内油红O 染色加深，脂质沉积现象明显增加，提示肝细胞发生脂肪性病变(图1)。

图1 油红O 染色评估游离脂肪酸诱导HepG2 细胞的脂肪性病变(×200)

2. Exendin-4 逆转由游离脂肪酸所导致的HepG2 细胞内sirt6 表达的下调:研究发现，棕榈酸可以显著降低HepG2 细胞内sirt6 的表达水平。与对照组相比，游离脂肪酸处理组中sirt6 表达水平约下降了50%，而当使用100nmol/L 的Exendin-4 处理24h后，则可以明显的逆转由游离脂肪酸所导致的sirt6表达的下调(图2)。这些结果提示Exendin -4 可能会影响肝细胞内sirt6 的表达。

图2 各组细胞中sirt6 蛋白表达水平变化

3.Exendin-4 可以通过激活sirt6 下调肝细胞内糖异生基因的表达:过去的研究发现GLP -1 可以通过影响肝脏的糖异生水平起降低血糖的作用。体内和体外的实验均证实GLP -1 可以通过抑制肝脏糖异生关键基因G6Pase 和PEPCK 的表达进而影响肝脏的糖异生。笔者的研究发现，Exendin-4 可以显著降低HepG2 内由游离脂肪酸对待所导致的G6Pase和PEPCK 两个糖异生关键基因mRNA 水平的升高。然而当使用基因干扰抑制sirt6 基因的表达后，sirt6在蛋白与基因水平的表达均被显著下调(图3)，而且Exendin-4 对糖异生的改善作用则消失不见(图4)。因此笔者认为sirt6 参与了Exendin-4 对肝脏糖异生作用的调节。

图3 sirt6 表达抑制后各组细胞sirt6 蛋白表达情况

图4 sirt6 表达抑制后各组细胞sirt6 及糖异生相关基因的表达情况

讨 论

非酒精性脂肪肝是由多种原因所导致的体内游离脂肪酸的增高，进而引起的肝脏脂质的过度堆积所引起的疾病［5］。随着人们生活水平的提高，非酒精性脂肪肝病的发生率呈现逐年上升的趋势。非酒精性脂肪肝患者主要表现为肝脏的胰岛素抵抗，而肝脏的胰岛素抵抗则是造成空腹及餐后血糖升高的主要原因之一。因此，非酒精性脂肪肝的发生、发展，与糖尿病及肥胖等代谢性疾病的发生、发展息息相关。棕榈酸和油酸是日常饮食中常见的长链脂肪酸。既往已有研究通过使用棕榈酸与油酸的混合物成功诱导了肝细胞的脂肪性病变［6］。在笔者的试验中，同样使用这种方法对细胞给予不同浓度和时间的游离脂肪酸对待后，通过对细胞活力以及凋亡的检测笔者选择对细胞毒性最低的药物剂量和作用时间，在进行细胞的油红O 染色后，笔者成功构建了HepG2 细胞的脂肪性病变模型。

Exendin-4 是一种胰高血糖素样肽-1 类似物，发挥GLP-1 受体激动剂的功能。因其具有葡萄糖刺激的促进胰岛素分泌、延缓胃排空以及抑制食欲等作用，是目前临床上较为有效的治疗2 型糖尿病的新型药物［7］。除了胰腺组织，最近的研究发现在肝脏组织同样存在GLP -1 受体的表达，并且GLP -1 对肝脏的糖脂代谢也有重要的调节作用［8］。GLP-1 可以有效地减少肝脏的脂质含量，降低体内胆固醇、甘油三酯以及转氨酶水平［9，10］。此外由于肝脏在维持体内血糖平衡中的重要作用，研究GLP -1 对肝脏肝糖分解以及糖原合成的影响也受到越来越多的关注。Fan 等［11］的研究发现，Exendin-4 治疗3 个月的小鼠肝脏中糖异生关键激酶G6Pase 和PEPCK 的表达水平显著下降。同时Lee 等［12］的研究也发现，对肥胖小鼠体内给予过表达GLP -1，通过下调糖异生关键激酶的表达，显著地降低了肝糖输出。

在笔者的实验中同样发现，在给予游离脂肪酸对待的肝细胞中，油红O 染色发现肝细胞发生明显的脂肪性病变，模仿了体内非酒精性脂肪肝的患病状态。同时检测肝细胞内糖异生关键基因G6Pase 和PEPCK 发现两者的表达水平被显著上调，但是在此基础上笔者同时对细胞给予GLP -1 类似物Exendin-4 处理后，这种由非游离脂肪酸所导致的肝脏糖异生水平的升高可以被显著逆转，由此可以说明Exendin-4 对肝脏脂肪性病变诱导的体内糖异生水平的升高具有明显的治疗效果。

Sirtuins 是一种NAD+的去乙酰化酶家族，在调节包括细胞活力、发育、染色质动力、DNA 修复以及代谢等生理过程中发挥重要作用［13］。sirt6 是该家族中的一员，特别参与调节哺乳动物的衰老以及代谢等过程［14］。研究发现体内过表达sirt6 可以有效降低血清甘油三酯以及胆固醇水平，而肝脏特异性敲除sirt6 则可以增加肝脏糖酵解以及甘油三酯的合成，并降低脂肪酸的β 氧化促进脂肪肝的发生［15］。Dominy等［16］的研究发现，这种调节主要与sirt6 参与调节GCN5 的去乙酰化进而导致PGC -1α 的乙酰化有关，而PGC-1α 又是肝脏糖异生基因表达的关键调节转录因子。鉴于以上的研究结果，笔者假设Exendin-4 可以具有通过对肝脏sirt6 表达的调控进而降低肝脏糖异生的作用。

通过笔者的实验发现，游离脂肪酸对待的肝细胞内sirt6 表达显著降低，而Exedin-4 联合处理后则可以相应改善这一现象。同时，笔者的实验通过siRNA干扰技术下调肝细胞内sirt6 的表达水平后，不但Exendin-4 对sirt6 表达的调控作用消失，同时Exendin-4 也无法显著抑制由高游离脂肪酸对待所导致的肝细胞内糖异生基因水平的升高。这些结果均说明在肝细胞内Exendin-4 可能是通过激活sirt6 进而影响肝脏的糖异生，起到减少肝糖输出降低血糖的作用。这些将为以后更好地应用GLP -1 类似物药物治疗非酒精性脂肪肝、胰岛素抵抗、2 型糖尿病以及相关代谢综合征提供理论依据。

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