响应面法优选天花粉总皂苷的提取工艺

黄庆勇， 叶 淼， 李 煌， 张玉琴， 褚克丹， 徐 伟， 乔丽菲， 张国良

（福建中医药大学药学院，福建福州350122）

响应面法优选天花粉总皂苷的提取工艺

黄庆勇， 叶 淼， 李 煌， 张玉琴， 褚克丹， 徐 伟*， 乔丽菲， 张国良

（福建中医药大学药学院，福建福州350122）

目的利用响应面法对天花粉总皂苷的回流提取工艺进行优化。方法在单因素试验基础上，选取料液比、提取时间、乙醇体积分数和提取温度为自变量，以天花粉总皂苷提取率为响应值，根据Box-Behnken中心组合设计原理，采用四因素三水平的响应面分析法。结果天花粉总皂苷提取的最佳条件为料液比1∶15，提取时间120 min，乙醇体积分数48%，提取温度88℃，提取2次，总皂苷提取率可达0.93%。结论该优选工艺稳定可行，实验真实值与建立的模型预测值基本一致。

天花粉；总皂苷；提取工艺；响应面法

栝楼属植物有80多种，其中我国有40多种，是栝楼属植物的主要分布中心［1］，其中栝楼常用于临床中药。天花粉来源于葫芦科植物栝楼Trichosanthes kirilowii Maxim.和双边栝楼Trichosanthes rosthornii Harms的干燥根，始载于《神农本草经》，具有清热涤痰、宽胸散结等功效，代表方有：栝楼桂枝汤、栝楼牡蛎散和栝楼瞿麦丸［2］。天花粉的主要成分包括蛋白质［3］、多糖、有机酸和三萜皂苷［4］等，具有抗病毒、抗炎和抗肿瘤等药理作用［5］。研究表明天花粉总皂苷能够清除DPPH自由基，具有体外抗氧化活性［6］，且对缺血性脑血管疾病具有较好的治疗作用［7］。

与传统的正交设计相比［8］，响应面法能够在给出的整个区域找到因素和响应值之间的一个明确的函数表达式，从而找到整个区域中因素的最佳组合和响应的最优值［9］。该方法已广泛运用于食品［10］，化工［11］，机械［12］，药学［13］等领域研究中。本实验通过单因素考察提取的时间、温度、溶剂和物料比，结合响应面法优选天花粉总皂苷的提取工艺，并验证该方法的可行性，旨在为天花粉总皂苷的工业化生产及保健产品的研发提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 材料 天花粉购自河北省安国市天康药材有限公司，经福建中医药大学杨成梓教授鉴定为葫芦科植物栝楼Trichosanthes kirilowii Maxim.的干燥根。齐墩果酸对照品（购买自成都曼思特生物科技有限公司，批号MUST-11090502，HPLC级），无水乙醇、冰醋酸、高氯酸、香草醛均为分析纯试剂。

1.2 仪器 CPA225D型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；UV-1800型紫外可见分光光度计 （岛津）；HH-2型数显恒温水浴锅 （国华电器有限公司）；RE-2000A型旋转蒸发器 （上海亚荣生化仪器厂）。

2 方法与结果

2.1 总皂苷测定方法［14］

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取齐墩果酸对照品1.90 mg，置于10mL量瓶中，加入无水乙醇超声溶解，稀释至刻度摇匀，即得0.19 mg/mL的齐墩果酸对照品溶液。

2.1.2 标准曲线绘制 精密吸取齐墩果酸对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置于10 mL的量瓶中，80℃恒温水浴蒸干，加入新鲜配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 m L，60℃反应10 min，冰浴冷却后，加冰醋酸稀释至刻度，摇匀，在550 nm波长下测定吸光度，以加入齐墩果酸对照品溶液0 mL的溶液为空白对照。以吸光度为纵坐标，齐墩果酸质量浓度为横坐标，得回归方程Y=4.471 0X-0.025 9（r=0.999 7），表明齐墩果酸质量浓度在0.038～0.190 mg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.1.3 供试品溶液的制备 将天花粉粉碎，过80目筛，精确称取天花粉粉末5.0 g，置于250 m L圆底烧瓶中，按单因素条件及Box-Behnken试验设计进行回流提取，提取2次，趁热滤过，合并滤液，减压浓缩至干，用适宜体积分数乙醇超声溶解，定容于10 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.4 精密度考察 取同一供试品溶液，按 “2.1.2”项下方法操作，连续测定6次，得RSD为1.54%，表明仪器精密度良好。

2.1.5 重复性考察 精密称取6份天花粉粉末，按“2.1.3”项下方法进行提取，按 “2.1.2”项下方法测定吸光度，RSD为1.92%，表明该方法重复性良好。

2.1.6 稳定性考察 取同一供试品溶液，按 “2.1.2”项下步骤，分别在0、5、10、30、60、120 min测定，得出总皂苷吸光度的RSD为0.72%，表明样品溶液在120 min内基本稳定。

2.1.7 加样回收率试验 取已知含有量的天花粉粉末 （总皂苷为0.73%）6份，分别加入齐墩果酸对照品约0.02 mg，按上述方法进行处理，测定各供试品溶液的吸光度值，按照公式 ［回收率 （%）=（加标样品实测值-样品测定值）/加入对照品量 ×100%］计算平均回收率为98.8%，RSD为2.65% （n=6），结果表明方法准确度较高，符合测定要求。

2.1.8 样品测定 精密量取0.2 mL供试品溶液，置10mL的试管中，80℃恒温水浴蒸干，按 “2.1.2”项下步骤进行测定。天花粉总皂苷提取率 （%）=天花粉总皂苷提取质量/天花粉量×100%

2.2 单因素试验 以天花粉总皂苷提取率 （Y）为考察指标，按 “2.1.3”项下方法进行处理，后按 “2.1.2”项下测定吸光度。分别考察料液比 （A）、提取时间 （B）、乙醇体积分数 （C）和提取温度 （D）对总皂苷提取率的影响 （见图1）。

图1 单因素试验结果

单因素试验结果表明：由图1A可知，当料液比为1∶15时，提取率最高，故选择1∶15为宜。由图1B可知，当提取时间为120 min时，提取率有最大值，随提取时间的增加，提取率没有明显增加，从经济效益方面考虑，选择120min较适合。由图1C可知，提取率在用50%乙醇溶液提取时最高，之后随乙醇体积分数的增大而减小，故选用50%乙醇进行提取。由图1D可知，提取率随提取温度的增加而增加，当温度为80℃时，提取率最高。

2.3 响应面实验考察

2.3.1 试验设计与结果 根据Box-Behnken中心组合试验设计原理［15］，在单因素试验基础上，以料液比 （A）、提取时间 （B）、乙醇体积分数 （C）和提取温度 （D）4个因素为自变量。每个自变量的低、中、高水平分别以-1，0，1进行编码，以天花粉总皂苷提取率 （Y）为响应值，因素水平见表1，试验安排及结果见表2。

表1 天花粉总皂苷的提取工艺Box-Behnken中心组合试验因素水平

表2 天花粉总皂苷的提取工艺Box-Behnken中心组合试验安排

2.3.2 响应面分析 利用ANOVA分析效应面的回归参数。采用DesignExpert8.0.6软件对表2中数据进行多元回归拟合，得到的二次多元回归方程：Y=0.91+0.032A+0.033B-4.167×10-3C+0.048D+7.50×10-3AB+0.080AC-0.013AD-0.020BC-0.045BD-0.043CD-0.063A2-0.064B2-0.082C2-0.035D2。回归方程中的各项系数见表3。

表3 回归方程的显著性检验及方差分析

由表3可知：F回归=22.63，P＜0.000 1，表明该模型极显著，方程与实际情况拟合良好；失拟项P=0.053 6＞0.05，失拟检测不显著，表明未知因素对试验结果干扰小；模型相关系数 R2=0.957 7，表明可信度良好；R2

Ad j= 0.915 4，说明91.54%的实验数据可用该模型进行解释。综上，该模型可以对天花粉中总皂苷提取工艺进行分析和预测。

回归方程各项方差分析表明，因素A，B，D，AC，A2，B2，C2对提取率影响极显著，因素BD，CD，D2具有一定的显著性，其余均不显著，表明各影响因素与总皂苷得率之间并非简单的线性关系。从F值可以看出，单因素的影响顺序为D＞B＞A＞C。

响应面分析立体图见图2，各图为当料液比 （A）、提取时间 （B）、乙醇体积分数 （C）和提取温度 （D）中任意两个变量取零水平时，其余两个变量对提取率的影响，可更加直观体现两个因素对提取率的影响。

图2A显示，当乙醇体积分数为50%、提取温度为80℃时，料液比和提取时间对总皂苷提取率的交互作用。根据等高线形状以及响应曲线陡峭程度，可判断两者的交互作用不显著。提取率随料液比或提取时间的增加或减少，变化不明显。

图2B显示，在提取时间为120 min、提取温度为80℃的条件下，料液比一定时，提取率随乙醇体积分数的增大，呈先增大后减小的趋势，当乙醇体积分数为60%时，提取率最小。当乙醇体积分数为40%时，提取率随料液比的增长，总体呈减小的趋势。等高线呈椭圆形，响应曲线坡度较陡，表示两者交互作用极显著。

图2C显示，料液比和提取温度对总皂苷提取率的交互作用。当乙醇体积分数、提取时间一定时，提取率随提取温度的升高而显著增加，随料液比增大也有一定增加趋势，当料液比约为1∶16时，有极大值。

图2 交互因素对总皂苷提取率影响的等高线及响应曲面图

图2D显示，当料液比为1∶15、提取温度为80℃时，提取率随提取时间及乙醇体积分数的增加，由低到高又降低，即提取率在适合的提取时间及乙醇体积分数小具有极大值。

图2E、2F显示，提取时间和提取温度，乙醇体积分数和提取温度交互作用显著，表现为响应曲线陡峭，等高线呈椭圆形且较密集，说明提取时间和提取温度，乙醇体积分数和提取温度对总皂苷提取率有一定的影响。

综上，料液比 （A）和乙醇体积分数 （C）对天花粉总皂苷得率的影响最显著。在给定范围内，提取温度越高（D），总皂苷的提取率越大；当料液比 （A）为1∶16时，提取率可能有极大值。

2.3.3 最佳条件的预测和验证试验 用DesignExpert软件对表2结果进一步处理，可得出最优条件为：料液比 （A）1∶15.15，提取时间 （B）120.16 m in，乙醇体积分数 （C）47.77%，提取温度 （D）88.13℃，天花粉总皂苷提取率的预测值为0.928%。考虑实际操作问题，以此条件的参数对工艺方法进行修正：料液比 （A）1∶15，提取时间 （B）120 min，乙醇体积分数 （C）48%，提取温度 （D）88℃。根据上述条件，平行测定3次，天花粉总皂苷提取率分别为0.937、0.931、0.928%，平均值为0.932%，RSD为0.49%，与预测值的偏差为0.43%。

3 讨论

前期工作中，曾比较不同溶剂 （甲醇、乙醇）和不同提取次数对天花粉总皂苷提取率的影响，结果发现不同溶剂提取率差别不显著，而随提取次数的增大，提取率增加不明显，从经济效益方面考虑，最后确定利用乙醇对天花粉进行提取，提取次数为2次。

本实验进行了29个实验点 （5个中心点）的响应曲面分析试验，相比目前国内多采用的正交设计或均匀设计优化工艺方法，可以评价指标和因素间的非线性关系，结果更精准，具有更强的指导性。实验比较了料液比、提取时间、乙醇体积分数和提取温度四个因素对提取率的影响，考察较全面。建立了二次多项回归模型，模型拟合良好，可用于天花粉总皂苷提取工艺的研究。最佳工艺条件确定为：料液比1∶15，提取时间120 m in，乙醇体积分数48%，提取温度88℃，天花粉总皂苷实测得率为0.932%。

天花粉能够降血糖［16］，对缺血性脑卒中［17］有一定的保护作用，但具体的有效部位及有效成分尚未阐明。本实验主要关注天花粉总皂苷的提取工艺，在今后工作中，将对其纯化工艺及药理活性进行深入探讨。

致谢:

本课题在康复技术协同创新中心和国家中医药管理局中医康复研究中心资助下完成。

本实验在福建省科技厅福建省中药学重点实验室中完成。

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：B

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2014-03-12

福建省科技厅重点项目 （2012Y0041）；福建省教育厅项目 （JA12176）；福建中医药大学校管科研课题 （X2013016）

黄庆勇 （1989—），男，硕士生，从事中药药剂及质量标准控制研究。Tel：15806034728，E-mail：hqy8910@163.com

*通信作者：徐 伟（1975—），男，副教授，硕士生导师，主要从事天然药物化学成分与活性研究。E-mail：xwfjtcm@sina.com

日期：2014-06-30

网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/31.1368.R.20140630.1350.001.html