重楼皂苷Ⅰ对人乳腺癌细胞MCF-7体内外生长的抑制作用

胡炜彦， 李 菊， 贺智勇， 付 昆， 张荣平*

（1.昆明医科大学药学院云南省天然药物药理重点实验室，云南昆明650500；2.昆明医科大学分子临床研究院，云南昆明650500；3.云南中医学院基础医学院机能实验室，云南昆明650500）

重楼皂苷Ⅰ对人乳腺癌细胞MCF-7体内外生长的抑制作用

胡炜彦1，2*， 李 菊3， 贺智勇2， 付 昆1， 张荣平1*

（1.昆明医科大学药学院云南省天然药物药理重点实验室，云南昆明650500；2.昆明医科大学分子临床研究院，云南昆明650500；3.云南中医学院基础医学院机能实验室，云南昆明650500）

目的探讨重楼皂苷Ⅰ（PSI）对人乳腺癌细胞株MCF-7体内外生长的抑制作用及其作用机制。方法CCK-8法检测重楼皂苷Ⅰ对MCF-7体外生长的抑制作用，将其接种于正常小鼠左前肢腋窝皮下复制MCF-7荷瘤模型，然后分为模型对照组、环磷酰胺 （30mg/kg）组和PSI高、中、低剂量 （60、30、15 mg/kg）组，腹腔注射给药，每天1次，连续15 d。末次给药后处死小鼠，剥离完整的肿瘤组织，称定质量，计算肿瘤抑制率，Western blot法检测凋亡相关因子Bcl-2、Bax和Caspase-3表达。结果PSI可显著抑制MCF-7生长，高、中剂量重楼皂苷Ⅰ组的作用更为明显（P＜0.01或P＜0.05），抑制率分别为64.34%和39.86%。另外，以上两组还可明显下调Bcl-2、Bax，上调剪切型Caspase-3表达（P＜0.01或P＜0.05）。结论重楼皂苷Ⅰ对MCF-7生长具有抑制作用，其机制可能与调节Bcl-2、Bax和Caspase-3有关。

重楼皂苷Ⅰ；MCF-7；Bcl-2；Bax；Caspase-3

乳腺癌是发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤，目前其发病率逐年上升，已成为全球范围内女性最常见的恶性肿瘤之一，不仅严重威胁女性的身体健康和生活质量，而且给全球卫生系统带来沉重的负担，已成为当前社会的重大公共卫生问题［1-2］。如今乳腺癌的治疗手段主要是手术和化疗，而化疗药物效果在一定范围内与剂量成正比，随着用药剂量增加，发生不良反应的风险也随之上升。另外，手术治疗又会给患者带来巨大的经济负担和身心伤害。因此，从天然植物中寻找安全有效的抗肿瘤药物是近年来的研究热点，中药及其有效成分的相关研究也已经取得很大进展［3］。研究发现［4-5］，中药活性成分能对乳腺癌细胞周期的相关基因和蛋白表达进行调控，直接或间接地影响细胞周期改变，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。同时，中药在预防乳腺癌及控制复发转移方面也有着不可忽视的作用。

重楼为百合科植物云南重楼Paris polyphylla Smith var. yunnanensis（Franch.）Hand.Mazz.或七叶一枝花Paris polyphylla Smith var.chinensis（Franch.）Hara的干燥根茎，有小毒，具有清热解毒、消肿止痛等功效，用于治疗疔疮痈肿、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌打伤痛等症状，其活性成分主要是甾体皂苷［6］。本实验采用人乳腺癌细胞株MCF-7，建立小鼠荷瘤模型，观察重楼中的主要成分重楼皂苷Ⅰ（PSI）对MCF-7体内外生长的抑制作用，为乳腺癌治疗提供新的途径。

1 材料

重楼皂苷Ⅰ （PSI，云南植物药业有限公司研发中心，纯度为95%）。提取分离方法为云南重楼粗粉用75%乙醇提取，提取液减压浓缩后经大孔树脂柱层析，分离得到总皂苷类成分，再经正相和反相硅胶柱层析，即得；环磷酰胺 （CTX，云南省肿瘤病医院）。

清洁级C57小鼠60只，8周龄，雌雄各半，体质量18～22 g（昆明医科大学实验动物中心，动物使用许可证号SCXK［滇］-2011004）。

人乳腺癌细胞株MCF-7（中科院上海细胞生物学研究所），本实验室常规培养，生长于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液中，再置于37℃恒温，5%CO2饱和湿度条件下的培养箱中生长，取对数生长期细胞用于实验。

RPMI 1640培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亚砜DMSO（中生华美北京科技有限公司）；CCK-8试剂盒（美国Invitrogen公司）；β-actin抗体（美国Sigma公司）；Bcl-2、Bax抗体（美国BD公司）；Caspase-3、cleaved Caspase-3抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；RIPA蛋白提取液（150 mmol/L NaCl、1.0%NP-40、0.5%脱氧胆酸钠、0.1%SDS、50 mmol/L Tris-HCl，pH为8，美国Thermo Fisher Scientific公司）。

2 方法

2.1 CCK-8检测PSI对乳腺癌细胞MCF-7体外生长的抑制作用 将培养好的MCF-7配成1×105个/mL密度的单细胞悬液，接种到96孔板上，每孔100μL，然后置于CO2培养箱中，37℃，5%CO2浓度下培养24 h。然后，将不同质量浓度的PSI溶液 （5、10、20、40、80、160μg/mL）和CTX溶液 （5、10，20、40、80、160μg/mL）依次加到预先铺好细胞的96孔板上，每孔100μL，设置3个平行孔。药物分别处理24和48 h后，每孔加入CCK-8溶液20μL，设置加入相应量细胞培养液、药物和CCK-8溶液，但没有加入细胞的孔作为试剂空白对照，在细胞培养箱内继续孵育1 h，450 nm下测定吸光度，计算各组细胞活力，公式如下。

各组细胞活力=各组吸光度/溶剂空白对照组吸光度×100%

2.2 复制荷瘤动物模型 将培养好的MCF-7配成1×107个/mL密度的单细胞悬液，取其中0.2 mL接种于正常小鼠左前肢腋窝皮下，制备荷瘤模型。

2.3 动物分组与给药 接种24 h后，将荷瘤小鼠随机分为5组，分别为模型对照组 （生理盐水）、CTX（30 mg/kg）组和PSI高、中、低剂量 （60、30、15 mg/kg）组。每天上午9点腹腔注射给药，给药量为20mL/kg，连续15 d。

2.4 抑瘤率的测定 末次给药24 h后，脱颈法处死小鼠，无菌条件下剥取完整的肿瘤组织，称定质量，并按下列公式计算抑瘤率。

抑瘤率 （%）=（1-给药组平均瘤质量/模型对照组平均瘤质量）×100%。

2.5 蛋白质表达的测定

2.5.1 蛋白质的提取 将各组肿瘤组织样本在冰块上充分碾磨后，置于1.5mL离心管中，加入蛋白裂解液 （1 mL/ 100 mg，使用前加入1%的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂）。4℃下摇床震摇1 h，后离心15 min（4℃，13 000 r/m in），收集上清液。测定蛋白浓度后，将蛋白提取液按4∶1的体积比加入5×电泳样品缓冲液，沸水浴中煮5 min，使蛋白质充分变性，-80℃下储存备用。

2.5.2 蛋白质的测定 蛋白定量采用BCA试剂盒，按照说明书步骤操作，以BSA为标准测定蛋白浓度，用Model 2550 EIA reader在600 nm下读取OD值。

2.5.3 蛋白质的分离检测 5%浓缩胶和12%SDS-PAGE分离总蛋白，之后将蛋白质转移到PVDF膜，加入5%脱脂奶粉室温封闭2 h，封闭后的膜用TBST洗涤3次，加入一抗在4℃下孵育过夜，使抗原和抗体充分结合。接着，再用TBST洗涤3次，放入新杂交袋中，加入二抗以结合一抗，室温下孵育2 h，化学发光法进行检测，凝胶成像系统进行拍照成像，目的蛋白灰度值除以内参β-actin灰度值以校正误差，所得结果即为某样品的目的蛋白相对含量。

2.6 统计分析 所有数据均用x±s表示，并使用SPSS 11.0软件进行统计分析，采用单因素ANOVA（方差分析）法进行显著性检验。

3 结果

3.1 重楼皂苷Ⅰ（PSI）对乳腺癌细胞MCF-7体外生长的抑制作用 CCK-8法检测结果表明，与对照组相比，重楼皂苷Ⅰ对MCF-7具有明显的抑制作用，并呈一定的剂量依赖性。PSI处理24 h、48 h后的IC50分别为22.95、10.25 μg/mL；CTX处理24 h、48 h后的IC50分别为18.95、9.04 μg/mL，见图1。

图1 重楼皂苷Ⅰ和环磷酰胺对M CF-7细胞生长的抑制作用

3.2 重楼皂苷Ⅰ对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用 与模型对照组比较，PSI高、中剂量组的瘤质量显著减轻 （P＜0.01或P＜0.05），而且高、中、低剂量组的抑瘤率分别为64.34%、39.86%、20.28%，表明其对荷瘤小鼠的抑瘤作用呈剂量依赖性，见表1。

3.3 重楼皂苷Ⅰ对肿瘤组织中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达水平的影响 与模型对照组比较，重楼皂苷Ⅰ高、中剂量组Bcl-2、Bax水平明显降低（P＜0.01或P＜0.05），其剪切型Caspase-3水平明显上升 （P＜0.05），总Caspase-3水平无明显变化，cleaved Caspase-3/Caspase-3比值显著增加 （P＜0.01或P＜0.05），见图2。

表1 PSI对模型小鼠的抑瘤作用(x±s,n=10)

图2 重楼皂苷Ⅰ对肿瘤组织中凋亡相关蛋白表达的影响 (n=3)

4 讨论

乳腺癌是严重危害女性健康的恶性肿瘤，统计数据表明，乳腺癌居女性癌症发病的第1位，死亡率居女性癌症死因的第6位，其患病率逐年上升，大中城市尤为突出［2，7］。目前，皂苷抗肿瘤机制为中药抗肿瘤研究热点之一。Cheng等［8］证实，大豆皂苷具有抗癌性。尤玲玲等［9］报道，苦瓜皂苷具有抗肿瘤细胞增殖的活性。重楼具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊之功效，用于臃肿、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌打伤痛、凉风抽搐等症状的治疗。除此之外，它作为民间抗癌药，还广泛应用于治疗恶性淋巴瘤、肺癌、鼻咽癌、脑肿瘤及消化系统肿瘤等［10］。

重楼皂苷为重楼的主要活性物质，具有抗肿瘤、消炎、止血、抗氧化、促进子宫收缩和保护血管内皮细胞等药理作用。文献 ［11］报道，它具有抗肿瘤及免疫调节作用，能显著抑制多种肿瘤细胞及移植瘤，并诱导其凋亡。PSI是从重楼中提取的甾体皂苷，研究表明它在体内外均具有很强的抗肿瘤作用［12-13］。

本实验对重楼皂苷Ⅰ体内外抑制乳腺癌MCF-7生长的情况进行了研究。CCK-8法检测结果显示，重楼皂苷Ⅰ在体外能显著抑制MCF-7生长，并呈一定的时间和剂量依赖性，处理24 h、48 h后的IC50分别为22.95、10.25μg/mL。另外，体内实验结果显示，PSI能显著抑制MCF-7荷瘤小鼠肿瘤的生长，高、中剂量重楼皂苷Ⅰ对其抑制率分别为64.34%、39.86%。Western blot法检测结果显示，与模型对照组相比，高、中剂量重楼皂苷Ⅰ可明显降低肿瘤组织中Bcl-2和Bax水平，同时上升剪切型Caspase-3水平。

诱导肿瘤细胞凋亡在肿瘤治疗中有着重要意义，已有许多研究证实，重楼抑制肿瘤细胞生长是通过凋亡途径来实现的。Xiao等［12］发现，重楼皂苷Ⅰ通过线粒体途径促进细胞凋亡，抑制裸鼠卵巢癌移植瘤模型的肿瘤生长。高冬等［14］报道，重楼可能是通过诱导癌细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用。Yan等［15］研究表明，重楼皂苷能显著诱导肺腺癌LA795细胞凋亡。本实验发现，重楼皂苷Ⅰ能够显著抑制MCF-7体内外生长，其机制可能是通过调节细胞凋亡蛋白表达，进而诱导细胞凋亡实现的，这将为乳腺癌的临床研究和开发新的抗乳腺癌药物提供实验基础。但是，由于本实验仅选择了一株人乳腺癌细胞株，相关指标不够全面，因此需要在以后实验中做更广泛深入的研究。

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R966

：B

：1001-1528（2015）07-1582-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.043

2014-03-12

云南省高校重点实验室基金项目 （2011YXZD07）

胡炜彦（1978—），女，硕士，讲师，从事药学教学科研工作。E-mail：huweiyan2004@163.com *通信作者：张荣平 （1964—），男，博士，教授，从事天然产物研究开发工作。E-mail：zhrp@163.com