健康志愿者多剂量服用左金丸对CYP3A4活性的影响

刘松灿， 裘福荣， 缪 萍， 朱蕾蕾， 曾 金， 李秋月， 贺 敏， 蒋 健

（上海中医药大学附属曙光医院临床药理科，上海201203）

[临床]

健康志愿者多剂量服用左金丸对CYP3A4活性的影响

刘松灿， 裘福荣*， 缪 萍， 朱蕾蕾， 曾 金， 李秋月， 贺 敏， 蒋 健*

（上海中医药大学附属曙光医院临床药理科，上海201203）

目的研究健康受试者口服左金丸对细胞色素P450酶3A4（CYP3A4）活性的影响。方法采用随机开放两周期试验设计，16名健康受试者 （男女各半）口服左金丸7 d（每天2次，每次3 g）前、后再分别单剂量口服咪达唑仑15 mg，LC-MS/MS测定咪达唑仑及其代谢物1-羟基咪达唑仑在24 h内不同时间点的血药浓度，WinNonlin软件计算咪达唑仑及1-羟基咪达唑仑的主要药代动力学参数。结果服用左金丸前后，受试者血浆中咪达唑仑的Cmax分别为（138.44±62.55）ng/mL、 （132.99±64.74）ng/m L；AUC0-24分别为 （305.25±112.05）ng·h/mL、（343.68± 149.39）ng·h/mL；tmax分别为 （0.5，0.25-2）h、（0.5，0.25-3）h；t1/2分别为 （3.52±1.06）h、（3.99±1.30）h；清除率 （CL/F）分别为 （54.65±17.65）L/h、（49.74±17.88）L/h；Cmax代谢比分别为（0.60±0.24）、（0.42± 0.18）；AUC0-24代谢比分别为 （0.53±0.18）、（0.41±0.14）。结论口服左金丸7 d对CYP3A4有弱抑制作用。

左金丸；细胞色素P450酶3A4；咪达唑仑；药物相互作用

随着中医药在临床上的广泛应用，中西药间的相互作用（herb-drug interaction）日益受到人们的关注。细胞色素P450 3A（CYP3A）是CYP主要亚家族，参与50%以上药物代谢，而左金丸与CYP3A4底物药联用在临床上十分普遍。左金丸为临床常用中成药，具有泻火疏肝和胃止痛的功效，临床上用于治疗肝火犯胃证［1-2］，现代研究认为，左金丸具有镇痛、抗炎、抗溃疡，抑制胃液、胃酸、胃泌素分泌和胃蛋白酶活性，目前用于治疗各种胃病［3］。左金丸由黄连与吴茱萸质量比6∶1组成，其中有效成分为小檗碱、黄连碱、巴马汀、药根碱等黄连生物碱和吴茱萸碱、吴茱萸次碱等吴茱萸生物碱组成［1-2］。有报道黄连生物碱对人CYP3A4酶有轻度抑制作用［4］，小檗碱具有轻度抑制人体内CYP3A4活性［5］。吴茱萸次碱在人肝微粒体中对CYP3A4有抑制作用［6-7］。Iwata报道吴茱萸次碱在人肝微粒体中具有机制性抑制作用［8］。所以选用健康志愿者口服CYP3A4体内探药马来酸咪达唑仑片进行左金丸对人体CYP3A4是否具有抑制作用的研究，该研究结果对临床合理使用左金丸具有指导作用。

1 材料、对象与方法

1.1 药品、试剂与仪器 左金丸，规格为每瓶18 g，批号120301（湖北诺得胜制药有限公司）；马来酸咪达唑仑片 （商品名力月西），规格为每片15 mg，批号20111201（江苏恩华药业股份有限公司）；咪达唑仑对照品 （纯度 ＞98%，批号171265-201001）、地西泮对照品 （内标，纯度 ＞98%，批号115-9302），均由中国食品药品检定研究院提供；1′-羟基咪达唑仑对照品，纯度＞99%，批号59468858（美国Sigma公司）。甲醇和乙腈为色谱纯 （美国Tedia公司）；甲酸和乙酸铵为分析纯 （国药集团化学试剂有限公司）；实验用水为去离子水（美国Millipore公司超纯水系统制备）。

API 4000串联质谱仪，配置电喷雾离子化源（ESI）、三级四极杆质量分析器和Analyst 1.4.2数据处理软件（美国ABI/SCIEX公司）；Agilent1200高效液相色谱仪，配置四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器和柱温箱（美国Agilent公司）；Thermo超低温冰箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）；XS-105电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Millpore-Q纯水系统（美国Millipore公司）；Labconco离心浓缩仪（美国Labconco公司）；Backman Allegra 64R高速冷冻离心机（美国Backman Coulter公司）；漩涡混合器 （上海沪西分析仪器厂）；电热恒温振荡水槽 （上海一恒科技有限公司）。

1.2 受试者选择 16名健康受试者，男、女各半，年龄 （24.38±1.96）岁，体质量 （60.6± 8.09）kg。试验前经血尿常规、血生化、胸片、心电图检查均未发现异常；受试者无药物过敏史和药物依赖史，无精神病史及其他慢性病史。试验前2周内未服任何药物。受试者均知情同意并签署知情同意书。

1.3 给药方案与血样采集 采用随机开放2周期试验设计［9-10］，试验方案经上海中医药大学附属曙光医院医学伦理委员会批准。

受试者于试验前晚住院观察，禁食10 h后，于受试日早晨8点空腹口服马来酸咪达唑仑片15 mg，用温开水200 mL送服。服药后2 h自由饮水，4 h后统一进餐。试验期间禁烟、酒及含咖啡因的饮料，避免剧烈活动。

分别于服药前 （0 h）及服药后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24 h采集上肢静脉血4 m L，置肝素化离心管中，3 000 r/min离心10 min，分离血浆，-80℃保存，待测。受试者自第2天起口服左金丸，每次3 g，每天2次，连续服用7 d，于第7天晚入住Ⅰ期病房。第8天早晨空腹口服马来酸咪达唑仑片15 mg和左金丸3 g，采血时间点、分离血浆及保存样本同前。

1.4 血浆中咪达唑仑及1-羟基咪达唑仑测定方法［11-12］

1.4.1 血浆样品处理 取血浆样本300μL，加入地西泮乙腈溶液 （内标100 ng/mL）10μL及1 mol/L NaOH 30μL，涡旋混匀30 s后，加入乙酸乙酯1.5 mL，涡旋振荡3 min，12 000 r/min离心10 min。转移上清液置于1.5 mL离心管中，55℃下氮气吹干，残渣用流动相100μL溶解，混匀后，12 000 r/min离心10 min，取上清液进入LC-MS/ MS分析。

1.4.2 色谱条件 Aglient Eclipse XDB-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为4 mmol/L乙酸铵和0.08%甲酸水溶液-甲醇 （30∶70）；柱温30℃；体积流量0.8 m L/min；进样量10μL。

1.4.3 质谱条件 电喷雾离子源 （ESI）；多反应检测 （MRM）模式扫描；极性正离子 （+）；喷射电压 （IS）4 500 V，离子化温度 （TEM）400℃，喷雾气压（GS1）50 psi（1 psi=6.895 kPa），辅助气压（GS2）50 psi；咪达唑仑m/z326.4→291.2，去簇电压（DP）105.14 V，碰撞电压（CE）35.88 V，碰撞室射出电压 （CXP）13 V；1-羟基咪达唑仑m/z342.2→324.0，DP 91.05 V，CE 33V，CXP 17.94 V；内标地西泮m/z 285.2→193.1，DP 98.06 V，CE 43 V，CXP 12 V。

1.5 方法学考察 在上述色谱条件下，咪达唑仑、1-羟基咪达唑仑和内标 （地西泮）的保留时间分别为2.63、2.21和3.15 min，峰形良好，血浆中内源性物质及其他杂质不干扰测定。血浆中咪达唑仑及其代谢物1-羟基咪达唑仑的质量浓度线性范围分别为0.25～250 ng/mL和0.15～150 ng/mL，定量下限分别为0.25 ng/mL和0.15 ng/mL。线性回归方程分别为Y=1.66X+0.038 8（r=0.998 0）和Y=1.31X+0.036 8（r=0.996 5）。咪达唑仑和1′-羟基咪达唑仑的低、中、高3个质量浓度质控样品的日内、日间RSD均＜15%，提取回收率＞90%，无基质效应。咪达唑仑和1′-羟基咪达唑仑储备液于4℃存放1周、血样在室温中存放4 h、血样处理后在自动进样器放置24 h、3次反复冻融、-80℃长期保存2月时皆稳定，符合生物样品分析方法的要求。

1.6 数据处理与分析 试验数据采用WinNonlin软件（4.1版，美国Pharsight公司）计算药代动力学参数。达峰浓度Cmax和达峰时间tmax为实测值，末段消除斜率 （λ）为对数血药浓度-时间曲线末端直线部分的斜率，消除半衰期t1/2=0.693/λ，梯形法计算血药浓度-时间曲线下面积AUC0-t值和AUC0-∞值，清除率（CL/F）=D/AUC0-∞，D为服用的药物剂量。AUC的代谢比（MRAUC）为1-羟基咪达唑仑的AUC/咪达唑仑的AUC；Cmax的代谢比（MRCmax）为1-羟基咪达唑仑Cmax/咪达唑仑Cmax。

药代动力学参数数据均用x±s表示，tmax用（中位数，最小值-最大值）。Cmax、AUC0-t和AUC0-∞在经对数转换后，由SAS 9.3软件中的GLM程序进行方差分析，并计算口服左金丸7 d与基线相比的几何均值及其90%可信区间，等效区间设定：Cmax为70.00%～143.00%，AUC0-t和AUC0-∞为80.00%～125.00%。tmax采用Willcoxon符号秩检验分析，Cmax，AUC0-t，AUC0-∞，t1/2和CL/F采用配对t检验分析，显著标准为P＜0.05。

2 结果

2.1 血药浓度-时间曲线 16名健康受试者口服左金丸7 d前、后单剂量服用CYP3A4探药马来酸咪达唑仑片15 mg后，咪达唑仑及1-羟基咪达唑仑的平均血药浓度-时间曲线见图1。

2.2 药动学参数 16名受试者口服左金丸7 d前、后单剂量服用马来酸咪达唑仑片 （15 mg）的咪达唑仑及其代谢物1-羟基咪达唑仑的主要药动学参数见表1。

图1 咪达唑仑和1-羟基咪达唑仑的平均血药浓度-时间曲线Fig.1 Plasma concentration-time profiles ofm idazolam (A),and 1-hydroxylm idazolam(B)

表1 咪达唑仑和1-羟基咪达唑仑的药代动力学参数Tab.1 Pharmacokinetics parameters ofm idazolam and 1-hyd roxylm idazolam

与服用左金丸前的基线相比，服用左金丸7 d后，咪达唑仑Cmax、AUC0-24、AUC0-∞、tmax、CL/ F和t1/2经统计分析差异无显著意义 （P＞0.05），Cmax、AUC0-24、AUC0-∞90%可信区间在等效范围内，AUC0-24和 AUC0-∞的几何均值分别为110.75%和111.21%。

与服用左金丸前的基线相比，服用左金丸7 d后，1-羟基咪达唑仑的AUC0-24、AUC0-∞、tmax和t1/2经统计分析，差异无显著意义 （P＞0.05），而Cmax明显低于基线值 （P＜0.05），Cmax90%可信限低值小于70%，AUC0-24和AUC0-∞90%可信区间在等效范围内。

与服用左金丸前的基线相比，服用左金丸7 d后，AUC0-24代谢比和 Cmax代谢比减少 （P＜0.05）。

3 讨论

因咪达唑仑经CYP3A代谢，主要产生1-羟基咪达唑仑，FDA将咪达唑仑作为表示体内外CYP3A催化活性的探药。本研究受试者口服左金丸3 g/次，每天2次，连服7 d后，咪达唑仑AUC0-24、AUC0-∞90%可信区间在80%～125%范围内，但接近上限，几何均值高出基线值约11%；1-羟基咪达唑仑Cmax的90%可信区间在低限之外，几何均值为62.58%，AUC0-24和AUC0-∞90%可信区间在80%～125%范围内，但接近下限，其几何均值低于基线值11%左右；AUC0-24和Cmax代谢比明显减少 （P＜0.05）。受试者口服左金丸7 d后，由咪达唑仑经CYP3A代谢生成1-羟基咪达唑仑量减少，导致1-羟基咪达唑仑的体内暴露量相对减少，提示CYP3A酶被抑制。CYP3A在肠道和肝脏中有高表达［11-12］，受试者口服左金丸7 d后，咪达唑仑吸收增多，其代谢物1-羟基咪达唑仑吸收相对减少，说明左金丸抑制肠腔CYP3A；但吸收入血咪达唑仑的消除半衰期 （t1/2）无明显变化，说明左金丸对肝脏CYP3A无抑制作用，对咪达唑仑的消除无影响。可能与左金丸抑制CYP3A的成分在肠腔的浓度较高，吸收进入肝脏的量较少有关［13］。

在前期体外研究发现，左金丸中的黄连提取物、吴茱萸提取物对CYP3A有抑制作用，IC50分别为140.8μg/mL和240.4μg/m L（数据未发表）。口服左金丸3 g/次，每天2次，肠腔中抑制CYP3A成分可达到抑制浓度［14］。

临床所用药物有50%是CYP3A4底物药，而左金丸是临床常用中成药，与其他药物联用可能性大。当左金丸与CYP3A4联用时，可能会引起代谢性相互作用，虽抑制程度较轻，但也应注意不良反应发生。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：630.

［2］张保国，刘庆芳.左金丸现代临床新用［J］.中成药，2010，32（8）：1408-1411.

［3］杨宏博，肖小河，赵艳玲，等.黄连、吴茱萸药对的研究进展［J］.中国药房，2010，21（15）：1432-1434.

［4］Han Y L，Yu H L，LiD，et al.In vitro inhibition of Huanglian［Rhizoma coptidis（L.）］and its six active alkaloids on six cytochrome P450 isoforms in human livermicrosomes［J］.Phytother Res，2011，25（11）：1660-1665.

［5］Guo Y，Chen Y，Tan Z R，et al.Repeated administration of berberine inhibits cytochromes P450 in humans［J］.Fur JClin Pharmacol，2012，68（2）：213-217.

［6］余 奇，郭 澄，程泽能.吴茱萸次碱的研究进展［J］.药学实践杂志，2007，25（6）：353-357.

［7］曹亚杰，曹 伟，余 奇，等.吴茱萸次碱在人肝微粒体中对细胞色素P450酶的抑制作用［J］.中南药学，2005，3（4）：243-245.

［8］Iwata H，Tezuka Y，Kadota S，et al.Mechanism-based inactivation of human liver microsoma CYP3A4 by rutaecarpine and limonin from Evodia fruit extract［J］.Drug Metab Pharmacokinet，2005，20（1）：34-45.

［9］Food and Drug Administration.Guidance for industry：drug interaction studies-study design，data analysis，implications for dosing and labeling recommendations［EB/OL］.［2012-02］. http：//www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm292362.pdf

［10］Bjomsson TD，Callaghan JT，Einolf H J，etal.The conductof in vitro and in vivo drug-drug interaction studies：a Pharmaceutical Research and Manufacturersof America（PhRMA）perspective［J］.JClin Pharmacol，2003，43（5）：443-469.

［11］Qiu F，Jiang J，Ma Y，etal.Opposite effectsofsingle-doseand multidose administration of the ethanol extract of Danshen on CYP3A in healthy volunteers［J］.Fvid Based Complement Alternat Med，2013，2013：1-8.

［12］Qiu F，Wang G，Zhang R，etal.Effectof Danshen extracton the activity of CYP3A4 in healthy volunteers［J］.Br J Clin Pharmacol，2011，69（6）：656-662.

［13］华雯妍，张全英，丁 黎，等.LC-MS法研究健康人体盐酸小檗碱片的药代动力学［J］.药学与临床研究，2009，17（6）：465-468.

［14］张新峰，裘福荣，蒋 健，等.LC-MS/MS同时测定左金丸和香连丸中6种生物碱的含量［J］.中成药，2010，32（4）：597-600.

Activity of CYP3A4 influenced by Zuojin Pills taken in healthy Chinese volunteers

LIU Song-can， QIU Fu-rong*， MIAO Ping， ZHU Lei-lei， ZENG Jin， LIQiu-yue， HE Ming，JIANG Jian*
（Department of Clinical Pharmacology，Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional ChineseMedicine，Shanghai201203，China）

Zuojin Pills；CYP3A4；midazolam；herb-drug interaction

R287

：A

：1001-1528（2015）07-1427-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.008

2014-04-18

国家科技部新药重大创制项目 （2012ZX09303009-001）；国家自然科学基金项目 （81173118）；上海中医临床重点实验室项目 （C10dZ2220200）。

刘松灿，男，博士，研究方向为中药临床药理学。

*通信作者：裘福荣 （1966—），男，博士，硕士生导师，主任药师，研究方向为临床药代动力学。E-mail：Furong_qiu@126.com蒋 健（1956—），男，博士，博士生导师，主任医师，研究方向为中药临床药理学。E-mail：jiangjiansg@126.com