天然彩色蚕茧茧层中色素含量及抗氧化物活性的测定

丁 农， 张金卫， 金瑞丰， 李江涛， 冯世明， 鱼南洋， 陆 萍， 李卫旗*

(1.湖州市农业科学研究院，浙江湖州 313000；2.浙江大学湖州市南太湖现代农业科技推广中心，浙江湖州 313000)



天然彩色蚕茧茧层中色素含量及抗氧化物活性的测定

丁 农1， 张金卫1， 金瑞丰1， 李江涛1， 冯世明1， 鱼南洋1， 陆 萍2， 李卫旗2*

(1.湖州市农业科学研究院，浙江湖州 313000；2.浙江大学湖州市南太湖现代农业科技推广中心，浙江湖州 313000)

[目的] 为彩色茧蚕丝蛋白应用于化妆品等产品开发提供依据。[方法]对几个不同颜色的彩色茧蚕品种进行茧层色素含量和抗氧化性能测定。[结果] 绿色茧茧壳中类黄酮色素的含量最高，为0.521 mg/g，是白色茧的4.65倍;黄色茧茧壳次之，而白色茧和红色茧最低。黄色茧和红色茧类胡萝卜素含量均在0.5 mg/g以上，是白色茧和绿色茧的8倍以上。绿色茧茧层中抗氧化物活性最高，为217.5 U/g；黄茧茧层中抗氧化物活性次之，而红茧和白茧较低。[结论]与白色蚕茧相比，绿色蚕茧含有较高的类黄酮，而黄色茧和红色茧有较高的类胡萝卜素，抗氧化能力也是天然彩色茧显著高于白色茧。

天然彩色茧；色素含量；抗氧化物；测定

茧丝的化学组成主要有丝素和丝胶2种蛋白质，其占比丝素蛋白约为75%，丝胶蛋白约为25%。我国的蚕茧生产除了主要作为丝绸服饰面料及蚕丝被的原料外，正在向生物医药材料、化妆品材料和保健食品材料等非传统应用领域的拓展[1]。茧色受控于基因表达的天然彩色茧品种由于其茧丝中的色素来源于蚕食下的桑叶或蚕体内的合成，色泽柔和、自然及环保，其开发利用价值已经引起人们的重视，可共生产应用的天然彩色茧品种也相继育成[2]。与普通白色茧相比，天然彩色茧富含有类黄酮色素和类胡萝卜素色素等生物活性物质，在缫丝生产过程也产生大量的富含天然有机色素的茧衣和下茧、长吐等下脚料副产品，如果将它们回收二次利用，作为富含类黄酮、类胡萝卜素的蚕丝蛋白原料开发化妆品等产品将对资源的综合利用和保护环境都有十分重要的意义。笔者对选育的几个不同颜色的彩色茧品种进行了茧层色素含量与抗氧化性能测定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1供试品种。选育的黄色茧金玉、绿色茧LJ、红色茧RC，以白色茧秋丰为对照。

1.1.2主要试剂。芦丁标准品、β-胡萝卜素、标准SOD(15KU)、黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶(均为Sigma公司产品)以及甲-萘胺、盐酸羟胺、对氨基苯磺酸、亚硝酸钠、75%乙醇和磷酸缓冲液(65 mmol/L，pH 7.8)。所用试剂均为分析纯。

1.1.3主要仪器。岛津 UV-2450紫外分光光度计、台式离心机、超声波仪、电热恒温水浴锅、立式压力蒸汽灭菌器、恒温烘箱。

1.2 方法

1.2.1蚕茧茧壳中色素和抗氧化物的提取。取干净的供试蚕茧茧壳用纯水洗涤后冷风吹干，剪碎后用电子天平准确称取0.5 g，放入洁净试管中，加入10 ml 75%的乙醇，然后超声波仪超声30 min，再在60 ℃的水浴锅里抽提4 h，过滤后去除杂质，收集第1次抽提的滤液，将剩余的残渣重复抽提1次，将滤液合并定容于25 ml标准容量瓶中，放置于4 ℃的冷藏箱中过夜，测定时吸取上层液作为试验的试样液。

1.2.2黄酮类色素的测定。类黄酮的测定采用硝酸铝显色法[3]，具体原理为黄酮化合物在有亚硝酸钠和中性条件下与铝盐反应生成螯合物，在加入氢氧化钠溶液后呈现红橙色，在499 nm处有最大吸收波峰，然后用比色法测定黄酮类化合物的含量。

1.2.2.1芦丁标准曲线的建立。用电子天平准确称取10 mg芦丁标准品，用50 ml的容量瓶定容为0.2 mg/ml的标准溶液。然后分别取标准溶液0、1、2、4、5和6 ml后加入5%的NaNO2溶液300 μl，混匀后静置6 min，再加入10%的Al(NO3)3溶液300 μl，混匀后静置6 min，然后加入1 mol/L NaOH溶液4 ml，混匀后加入75%的乙醇定容为25 ml，使芦丁标准品溶液的浓度分别为0、0.008、0.016、0.032、0.040和0.048 mg/ml，在波长499 nm下测定其吸光度值，空白对照用纯水作同样处理，3次重复。得到回归方程为：Y=12.329 9X-0.000 3，相关系数为R2=0.998 9。测试样品的浓度与其对应的吸光度之间呈现良好的线性关系(图1)。

1.2.2.2试样黄酮类色素含量的测定。取试样液5 ml，加入5%的NaNO2溶液300 μl，摇匀静置6 min后再加入10%的Al(NO3)3溶液300 μl，混匀静置6 min后加入1 mol/L NaOH溶液4 ml，混匀后再加入75%的乙醇定容至10 ml，然后用分光光度计于499 nm处测定其吸光度，空白对照用纯水并作相同处理。根据检测到的吸光度值计算出样品中的类黄酮含量，然后依据将0.5 g茧壳抽提出25 ml的试样液和稀释倍数，计算出供试蚕茧单位重量茧壳的类黄酮含量。

1.2.3类胡萝卜素的测定。类胡萝卜素的测定采用光度法测定[4]，具体原理为：类胡萝卜素易溶于有机溶剂而不溶于水，可用乙醚提取分离。皂化剂KOH-CH3OH能与供试液中的类黄酮及含羧基、羟基的色素生成可溶于水的盐，类胡萝卜素则无此类反应，因而可用乙醚将类胡萝卜素抽提出来，达到将类胡萝卜素与其他色素分离的目的。β-胡萝卜素的最大吸收波峰是449 nm，采用比色法对照标准曲线测定试样液含量。

1.2.3.1β-胡萝卜素标准曲线的建立。用电子天平精确称取β-胡萝卜素0.5 mg，置于50 ml的容量瓶中加入75%的乙醇溶液定容成为0.01 mg/ml的标准液，分别取0、1、2、4、5和6 ml 0.01 mg/ml的标准溶液置于25 ml的容量瓶中，得到0、0.4、0.8、1.6、2.0和2.4 μg/ml的标准溶液。然后，在波长449 nm处测定其吸光度，空白对照用纯水作同样处理，3次重复。得到回归方程为Y=0.163 8X-0.004 3，相关系数为R2=0.999 7。从图2可以看出，β-胡萝卜素浓度与其对应的吸光度值具有良好的线性关系。

1.2.3.2试样类胡萝卜素含量的测定。取供试液1 ml，加入20%质量比的KOH-CH3OH溶液2.5 ml，置于4 ℃冷藏箱遮光条件下过夜，用分液漏斗加乙醚5 ml，将供试液移入再加入10%的NaCl溶液5 ml，静置分层后将上层滤液移入小烧杯，对下层液继续萃取，合并滤液，用10%的NaC溶液l5 ml洗涤4次，再倒入同样的烧杯中，加入2 g无水Na2SO4干燥处理30 min，然后用乙醚定容至10 ml，用分光光度计在波长449 nm处测定其吸光度值，对照用纯水作同样处理。根据吸光度值，计算出供试样类胡萝卜素的含量，然后依据0.5 g茧壳样品抽提为25 ml的供试液和测试液的稀释倍数计算出供试蚕茧单位重量茧壳的类胡萝卜素含量。

1.2.3抗氧化物的测定。采用黄嘌呤氧化-羟胺法[5]测定试样的抗氧化物SOD(超氧化物歧化酶)值，具体原理为:黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶反应系统产生的超氧阴离子自由基(O2-)，与羟胺反应生成亚硝酸盐，亚硝酸盐与甲萘胺和对氨基苯磺酸反应生成红色化合物，用分光光度计在530 nm下进行比色测定，而超氧化物歧化酶抑制此反应，使得超氧阴离子自由基(O2-)与羟胺反应产生的亚硝酸盐减少，据此来建立SOD百分抑制标准曲线，将供试样品的检测数据与标准抑制曲线对照，按照以下公式计算出供试样品提取液的抗氧化活性：SOD百分抑制率(%)=(对照管吸光度值-测定管吸光度值)/对照管吸光度值×100。

表1 SOD活性测定的方法

1.2.3.1SOD标准抑制曲线的建立。将标准品SOD用65 mmol/L的磷酸缓冲液配制成750 U/ml的溶液后稀释50倍，稀释成15 U/ml的SOD标准溶液。然后，再将其分别稀释为0、0.005、0.025、0.045、0.065、0.085、0.105、0.125、0.145、0.165和0.205 U/ml的标准溶液。最后，采用黄嘌呤氧化-羟胺法测定SOD的活性并建立标准抑制曲线。SOD的测定方法见表1。

按上述方法对SOD各浓度梯度标准溶液的活性测定，得到相对应浓度的SOD抑制率，建立SOD的标准抑制曲线。从图3可以看出，抑制率在65%以内时其SOD标准抑制曲线的线性良好。

1.2.3.2试样抗氧化物的测定。取按照“1.2.1”中的方法得到的供试液的上层液20 μl，测定试样的吸光度，计算试样液的SOD百分抑制率，对比标准抑制曲线获得供试液的抗氧化活性。

供试蚕茧单位重量茧壳的抗氧化物含量(U/g)，是将供试样品的检测数据与SOD标准抑制曲线进行比对，将检测样品的百分抑制率所对应的标准溶液SOD浓度值设定为W(SOD)(单位为U/ml)，再根据试样的稀释倍数按照以下公式计算：茧层的抗氧化物(U/g)=[W(SOD) U/ml×5.8 ml×25 ml]/(0.02 ml×0.5 g)。

2 结果与分析

2.1 不同色彩蚕品种茧壳的类黄酮色素含量从表2可以看出，绿色茧品种LJ茧壳中的类黄酮含量最高，达到0.521 mg/g，大幅高于其他品种，分别为黄色茧HJ、红色茧RC和白色茧品种秋丰的2.56倍、3.64倍和4.65倍。

表2 不同色彩蚕品种茧壳的类黄酮含量

2.2 不同色彩蚕品种茧壳的类胡萝卜素含量从表3可以看出，黄色茧品种金玉与红色茧品种RC的类胡萝卜素含量较高，其中黄色茧金玉为0.508 mg/g、红色茧RC为0.529 mg/g，是白色茧秋丰和绿色茧LJ的8～10倍左右。

2.3 不同色彩蚕品种茧壳的抗氧化物活性从表4可以看出，各种色彩的蚕茧均有抗氧化活性，其大小顺序依次为绿色茧LJ>黄色茧>红色茧RC>白色茧秋丰。由此可见，彩色茧与白色茧相比具有更高的抗氧化活性。

表3 不同色彩蚕品种茧壳的类胡萝卜素含量

表4 不同色彩彩色茧茧层抗氧化性的测定结果

3 结论与讨论

结果表明，与白色蚕茧相比天然绿色蚕茧含有较高的类黄酮，而天然黄色茧和红色茧有较高的类胡萝卜素，抗氧化能力也是天然彩色茧显著高于白色茧。现有的研究已经证实类黄酮和类胡萝卜素具有多种生理调节功能，其中类黄酮具有抗疲劳、调节血糖和抗自由基等功能，而类胡萝卜素具有抗氧化、抗衰老、提高免疫力等作用[6-9]。SOD作为生物体内的一种极为重要的天然抗氧化物，广泛存在于动植物和微生物中，具有生命体消除新陈代谢过程中有害物质的重要功能，可以有效清除自由基，提高免疫力和抗衰老[10]。选育天然彩色茧品种，生产开发天然彩色丝产品特别是保健内衣，产品色泽柔美，加工无需印染更加环保，而且含有天然色素和抗氧化物对皮肤的保健及亲和力更好，符合人们对“健康、绿色”的追求。目前，以SOD为主要护肤成分的化妆品和以蚕丝蛋白为主要护肤成分的化妆品层出不穷，以天然彩色茧原料开发出含有天然色素和抗氧化物质的蚕丝蛋白化妆品由于其天然环保的特点将会受到市场的更加青睐。笔者对保存的彩色茧育种材料进行了色素及抗氧化活性检测，由于彩色茧品种育种素材众多，各种茧色相似的彩色茧品种其色素和抗氧化活性表现是否一致，还有待于进一步研究。

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Determination of Pigment Contents and Antioxidant Property in the Shell of Natural Colorful Silkworm Cocoon

DING Nong1, ZHANG Jin-wei1, JIN Rui-feng1, Li Wei-qi2*et al

(1. Huzhou Academy of Agricultural Sciences, Huzhou, Zhejiang 313000; 2. South Taihu Agricultural Technology Extension Center of Zhejiang University, Huzhou, Zhejiang 313000)

[Objective] The research aimed to provide basis for the cosmetics development of colorful cocoon silk protein. [Method] The pigment contents and antioxidant property of shell of several natural colorful cocoon varieties were determined. [Result] The content of flavonoid in green cocoons was the highest (0.521 mg/g), which was 4.65 times as that in white cocoons. The content of flavonoid in yellow cocoons was the second and that in white cocoons and red cocoons. The content of carotenoid in yellow cocoons and red cocoons were all more than 0.5 mg/g, which was 8 times higher than white cocoons. In addition, the antioxidant activity in green cocoons were the highest (217.5 U/g), followed by that in yellow cocoons. The antioxidant activity in white cocoons and red cocoons was lower. [Conclusion] Compared with white cocoons, green cocoons had higher content of flavonoid, and yellow cocoons and red cocoons had higher content of carotenoid. And the antioxidant activity in natural colorful cocoon was higher than that in white cocoons.

Natural colorful cocoon; Pigment contents; Antioxidant; Determination

浙江省公益技术研究项目(2014C32085)； 湖州市科技攻关项目(2013GZ09)。

丁农(1961- )，男，浙江德清人，高级农艺师，从事蚕桑科研与技术推广。*通讯作者，副教授，从事农产品加工科研与教学。

2015-03-12

S 886

A

0517-6611(2015)11-139-03