弗氏完全佐剂致大鼠急性膝关节炎动物模型制备

陈德森 李 莉 吴胜英 彭吉霞 李贤玉

急性膝关节炎动物模型是基础药理学及临床疼痛研究较常用的实验模型［1］。以往常采用醋酸皮下注射法复制急性膝关节炎动物模型，本实验采用弗氏完全佐剂法复制膝关节炎动物模型，其病理形态及病理生理学改变与临床膝关节炎甚为相似，具有相似度极高的临床及生化检验特点，现就该动物模型制作介绍如下［2］。

材料与方法

1.实验动物:SPF 级Wistar 大鼠30 只，雌雄兼用，体质量180 ～250 g，由湖北省实验动物研究中心提供［SCXK(鄂)2011 -008］，饲养于屏障设施［SYXK(鄂)2011 -0031］。

2.药品与试剂:生理盐水、醋酸、弗氏完全佐剂(上海实生细胞生物技术有限公司)。

3.急性膝关节炎模型制备:采用数字表法将大鼠随机分为3 组(n=10):对照组、醋酸组、佐剂组。碘伏浸泡大鼠右足趾消毒，采用日本鬼头康彦的造摸方法，将弗氏完全佐剂0.5ml 注人右膝关节腔内，于第1、3、7 天各注射1 次［3］。根据临床上超疲劳容易提前出现骨关节炎的发病特点，每日强迫动物活动30min，14 天后出现以下与临床急性膝关节炎表现一致的症状即可确定大鼠急性膝关节炎模型造模成功:①关节及其周围僵硬、活动受限;②关节出现红、肿、热、痛、同时软组织肿胀或积液;③发病的部位常见于膝、髋、踝等关节处;④关节积液检查出现IL-1β 降低，HA 含量明显升高;⑤关节病理切片镜检出现关节腔大量渗出液，软骨表面粗糙，滑膜增生、粘连、肥厚等膝关节炎临床病理学改变。对照组注射等量生理盐水作对照，醋酸组注射97%醋酸0.5ml。注射后创口碘伏浸泡消毒1 周(每日1 次)以预防感染。参照文献［4］于造模后7、14 天分别抽取膝关节腔积液测定积液白细胞介素-1β(IL-1β)、透明质酸(HA)含量。

4.动物一般状况观察:动物的一般状况观察(包括自洁情况、摄食、饮水量、活动等)，存活情况。

5.膝关节肿胀百分率的测定:于造模前及造模后7、14 天用玻璃容器排水法测量:先取直径2cm 的30ml 量筒注入蒸馏水，液面与量筒最高处平齐，用10ml 注射器吸取量筒内蒸馏水约5ml。于每只大鼠右膝关节做一标记，然后把大鼠右足跖缓慢伸人量筒内，使标记与量筒最高处平齐。再用已吸入5ml水的注射器向量筒内缓慢注入蒸馏水并使液面再次与最高处及大鼠膝关节标记一致，读取注射器内剩余液体体积，即为大鼠的膝关节体积，重复3 次取平均值。并计算膝关节肿胀百公率:膝关节肿胀百分率(%)= (造模后容积- 造模前容积)/造模前容积×100%。

6.组织形态学检查:14 天后处死大鼠，迅速取各组动物膝关节滑膜标本用10%中性甲醛固定，1 周后常规脱水，石腊包埋，切片经HE 染色，光镜下观察组织形态。

7.统计学方法:采用SPSS 13.0 软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差(±s)表示，指标的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，组间差异则采用Dunnett 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1.大鼠一般情况的变化:对照组造模前及造模后7、14 天观察，大鼠体毛有光泽，反应敏捷，饮食正常，无死亡。醋酸组大鼠1 周后精神及自洁情况差，大鼠体毛发无光泽，醋酸刺激性太强引起动物剧痛舔足，关节肿胀，卷缩，拒绝活动，摄食及饮水量减少，无死亡，8 只大鼠造模成功，模型成功率为80%。佐侪组大鼠1 周后精神及自洁情况较醋酸组稍好，部分大鼠体毛无光泽，关节及其周围僵硬、活动受限，舔足，摄食及饮水量与正常大鼠无明显差别，无死亡，10 只大鼠均造模成功，模型成功率为100%。

2.膝关节积液中IL-1β、HA 含量:由表1 可见，对照组IL -1β、HA 无明显变化;醋酸组在造模后7天时测得IL-1β 小幅度升高、HA 含量有降低趋势，第14 天IL-1β 明显高于、HA 含量低于对照组(P ＜0.05);佐侪组在造模后7 天时IL-1β 即开始明显升高，HA 含量明显降低，第14 天测得IL-1β 升高达峰值、HA 含量大幅降低，与术前及醋酸组比较差异具有统计学意义(P ＜0.05)，说明弗氏完全佐剂能在更短时间促使炎性介质IL -1β 大量分泌释放，抑制关节保护介质HA 的分泌，破坏HA 对关节面的保护屏障而造成膝关节炎性反应。弗氏完全佐剂组生化测定与临床相符度高，表明弗氏完全佐剂能更好的复制急性膝关节炎。

表1 大鼠造模前及术后膝关节腔内IL-1β 及HA 含量的变化(±s，n=10)

表1 大鼠造模前及术后膝关节腔内IL-1β 及HA 含量的变化(±s，n=10)

与对照组比较，* P ＜0.05;与造模前比较，#P ＜0.05;与醋酸组比较，ΔP ＜0.05

组别 IL-1β(ng/ml)HA(mg/L)造模前 术后7 天 术后14 天 造模前 术后7 天 术后14天2.07 ±0.04 2.07 ±0.03醋酸组 19.19 ±0.25 24.94 ±0.27 25.54 ±0.37* 1.91 ±0.01 1.77 ±0.05 1.04 ±0.02*佐侪组 20.04 ±0.31 34.57 ±0.41* #Δ 41.47 ±0.48* #Δ 1.97 ±0.05 0.94 ±0.02* #Δ 0.73 ±0.01* #Δ对照组 18.32 ±0.24 17.91 ±0.24 18.23 ±0.23 2.01 ±0.05

3.膝关节肿胀百分率对比情况:对照组在造模后第7、14 天后关节无肿胀现象;醋酸组及佐剂组膝关节均出现不同程度的肿胀，醋酸组第7、14 天后关节肿胀百分率分别为22. 07% ± 0. 05%、21. 97% ±0.24%;佐剂组分别为36.21% ±4.71%、39.34% ±3.98%;数据显示佐剂组关节肿胀百分率高于醋酸组，其炎性反应更加明显(P ＜0.05)，说明弗氏完全佐剂复制急性膝关节炎动物模型更为成功(表2)。

表2 大鼠造模前及术后膝关节肿胀百分率(%)对比(±s，n=10)

表2 大鼠造模前及术后膝关节肿胀百分率(%)对比(±s，n=10)

与对照组比较，* P ＜0.05;与造模前比较，#P ＜0.05;与醋酸组比较，ΔP ＜0.05

项目 造模前术后7 天 14天0.02 ±0.00 -0.01 ±0.00 0.01 ±0.01醋酸组 -0.01 ±0.01 22.07 ±0.05* 21.97 ±0.24*佐侪组 0.01 ±0.00 36.21 ±4.71* #Δ 39.34 ±3.98* #Δ对照组

4.膝关节滑膜病理切片组织形态学检查:对照组(图1A)组织结构正常，无充血、水肿和中性粒细胞浸润。醋酸组(图1B)滑膜呈现充血、水肿和中性粒细胞浸润。而佐剂组(图1C)关节软骨表面粗糙，变暗呈灰黄色，并有裂纹、糜烂及溃疡形成;滑膜存在不同程度增生、粘连;关节液量增多，且呈泡沫状，滑膜血管扩张，血浆和细胞外渗，产生大量渗出液，滑膜肥厚、关节内粘连和淋巴细胞和浆细胞浸润;软骨细胞排列不规则，基质分布不均，表明弗氏完全佐剂致膝关节炎性反炎更为明显。

图1 14 天大鼠膝关节滑膜组织病理形态观察(HE，×40)

讨 论

膝盖滑膜炎又称膝关节滑膜炎，是一种多发性疾病［5，6］。当膝盖滑膜损伤后，关节腔滑膜血管扩张、充血、水肿及大量中性粒细胞浸润，造成关节肿胀及活动受限［7］。如不及时处理，会导致滑膜绒毛水肿、结缔组织纤维增生老化，造成滑膜组织再生及修复能力降低，严重者出现滑膜肥厚、关节粘连和软骨变性等病理改变，严重影响患者活动。故对膝关节滑膜炎的早期诊治显得尤为重要。本研究的目的就是为寻找一种病理形态及病理生理学改变与临床膝关节炎高度相似的动物模型用于研究膝关节滑膜炎。

关节炎的病理变化主要为软骨的破坏与变性，以及继发的滑膜与滑液炎性改变，是软骨分解与合成代谢失衡的结果。正常的关节滑液中仅含有微量的IL-1β，但在膝关节炎关节液中IL -1β 的含量则异常增高［8］。IL-1β 作为重要的炎性介质，具有细胞破坏能力。王庆甫等［9］证明关节软骨的破坏主要是由IL-1β 激发的。HA 是由D -葡萄糖醛酸和N -乙酰氨基葡萄糖胺二糖单位有规律重复构成的大分子链状多糖，化学本质为糖胺多糖，广泛分布于人及动物的结缔组织、眼玻璃体和滑液中，是关节滑液和软骨基质的重要组成部分，黏附于关节软骨表面，形成保护屏障，调整滑膜通透性，减低摩擦系数润滑关节腔，营养关节软骨，利于关节软骨修复［10］。

本研究发现，醋酸组在造模后第14 天测得IL -1β 明显升高、HA 含量降低，说明炎性介质分泌较晚;而弗氏完全佐剂组在造模后7 天即开始明显升高，HA 含量明显降低，第14 天测得IL-1β 升高达峰值、HA 含量显著降低，与醋酸组比较差异有统计学意义，说明弗氏完全佐剂能在更短时间内促使炎性介质IL-1β 大量分泌，抑制关节保护介质HA 的分泌，破坏HA 对关节面的保护屏障而造成膝关节炎性反应。在造模后第7、14 天时观察发现，醋酸组及弗氏完全佐剂均发生关节肿胀，但弗氏完全佐剂组膝关节炎性反应更明显，第7、14 天两次测得膝关节肿胀百分率明显大于醋酸组，其模型成功率达100%，明显优于醋酸组的80%。

在膝关节滑膜病理切片组织形态学检查中发现，弗氏完全佐剂组病理学改变较醋酸组更为严重，出现典型的膝关节炎临床病理学改变，如关节软骨细胞排列不规则，基质分布不均;关节表面粗糙，伴有裂纹、糜烂及溃疡形成;滑膜存在不同程度增生、粘连;关节腔大量渗出积液并呈泡沫状，滑膜肥厚、关节内粘连和淋巴细胞和浆细胞浸润等病理改变。目前急性膝关节炎动物模型大多采用关节腔注射醋酸法，但其缺点是醋酸刺激性太强，会引起动物剧痛，不太符合实验动物伦理及动物福利规范，且其IL-1β、HA 分泌释放改变比弗氏完全佐剂法出现的晚，病理改变亦不如弗氏完全佐剂典型［11］。本实验研究证实，大鼠膝关节腔内注射弗氏完全佐剂第7 天后IL -1β 释放即明显升高、HA 显著降低，具有典型的膝关节炎临床病理学改变，且这种病理改变较醋酸组更为明显，模型成功率高，IL-1β、HA 分泌改变出现早，动物疼痛幅度低，更符合实验动物伦理及动物福利规范要求，不失为一种较理想可靠的急性膝关节炎动物模型造模方法［12］。

1 施新猷.现代医学实验动物学［M］.北京:人民军医出版社，2000:464 -465

2 Gomes RP，Bressan E，Silva TM，et al.Effects of one minute and ten minutes of walking activity in rats with arthritis induced by complete Freund's adjuvant on pain and edema symptoms［J］. Rev Bras Reumatol，2014，54(2):83 -89

3 张晓轶，节晓光，张雅丽，等.“CHK”术式对兔膝OA 中SOD、MDA及NO 水平的影响［J］.贵州医药，2008 32(8):680 -684

4 Wang Z，Qiu Y，Lu Ji，et al.Connective tissue growth factor promotes interleukin-1β-mediated synovial inflammation in knee osteoarthritis［J］.Mol Med Rep，2013，8(3):877 -882

5 赵志华，李晓杰，胡书海，等.不同表面处理方法对纤维桩与牙本质之间粘接强度的影响［J］.大连医科大学学报，2010，2(2):125-129

6 黄蔚霞. 药物对痛风性关节炎模型IL -1、IL -6 的影响［J］. 中国中西医结合肾病杂志，2002，3(6):124

7 钱伯初，史红，郑晓亮，等.尿酸钠结晶诱导痛风性关节炎动物模型研究进展［J］.中国比较医学杂志，2008，18(6):65 -67

8 国延军，牟成林.祛瘀通痹汤对原发性膝骨关节炎白细胞介素一1β 亚型及前列腺素E2 含量的影响［J］. 河北中医，2010，32(2):257 -258

9 王庆甫，马玉峰，殷岳衫，等.低频超声促透中药对兔膝关节炎细胞因子的影响［J］.北京中医药大学学报，2013，36(2):108 -109

10 Bruyere SS.Glucosamine sulphate in the treatment of knee ostcoarthritis:cost - effectiveness comparison with paracetamol［J］. Int J Clin Pract，2010，64(6):756 -762

11 张建红，刘田福，武东梅，等. 生物医学研究中的实验动物福利问题［J］.中国实验动物学杂志，2001，11(1):62 -64

12 杨国斌.生物医学研究中实验动物伦理学问题的思考［J］.中国医学伦理学，2010，23(3):10 -13