血液中氨基酸含量的高效液相色谱及其质谱联用测定方法研究进展

王清华，熊筱娟，张 凤，高守红

(1. 宜春学院 化学与生物工程学院，江西 宜春 336000;2. 第二军医大学 长征医院药学部，上海 200003)

氨基酸是机体代谢的重要物质之一，具有广泛的生物学功能，是构成生物机体蛋白质分子的基本组成单位和维持内稳态重要的物质基础。人体内参与氨基酸代谢的相关蛋白和酶发生缺陷或者各种病理状态都会导致氨基酸代谢异常和血液氨基酸水平的改变。例如，对称二甲基精氨酸(SDMA)和非对称甲基精氨酸(ADMA)的变化能够较好地反映在肾脏疾病中肾功能受损伤的严重程度。［1－5］因此，监测生物样本中(血液、尿液等)的氨基酸含量具有重要的意义，［6－10］在临床上观测氨基酸的动态变化行为可以为相关疾病的诊断提供辅助依据。

目前，有关氨基酸分析方法研究的报道比较多，常用的有氨基酸分析仪测定法(amino acid analyzer，AAA)、高效液相色谱法(High－performance liquid chromatography，HPLC)，气相色谱法(gas chromatography，GC)，毛细管电泳法(Capillary electrophoresis，CE)等。近30 年来，随着质谱分析技术的出现与普及，作为一新兴的技术已经运用到了生命科学、生物化学、医学、食品等领域。因此，作为高特异性和高灵敏度检测工具的质谱，同样在分析生物样本中小分子氨基酸含量发挥着重要的作用。［11－13］本文主要对HPLC，液相色谱－质谱联用(HPLC－MS/MS 和UPLC－MS/MS)等技术在氨基酸定量分析中的应用进行了综述和评价。

1 液相色谱法

由于氨基酸的极性比较大，在普通的C18 反相色谱柱上保留行为极差，因此，在复杂的生物样本或非生物基质中，广泛地定量氨基酸是一个极大的挑战。在过去的60 年里，研究者为了使生物样本中的氨基酸能够达到有效地分离与检测，常用的分析方法是离子交换色谱分析结合茚三酮柱后衍生化法，此法首先将氨基酸分离，再进行衍生化处理并进行紫外检测。此方法样品用量大且缺乏特异性，［14］氨基酸衍生化后，必须在紫外条件下检测，灵敏度低，不适合某些微量氨基酸定量，且成本代价高;柱前衍生化HPLC 法，采用不同的衍生化试剂，例如丹磺酰氯(Dansyl－Cl)、异硫氰酸苯酯(PITC)、邻苯二甲醛(OPA)、6－氨基喹啉－N－羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯(AQC)等，样本处理步骤复杂，干扰因素较多，分析时间长且耗费高，且无法达到临床上高灵敏、高通量、高特异性的分析要求。在临床血液样本中，化合物数量多且复杂，一些化合物跟氨基酸结构相似或分子量相同，则有可能保留时间相同，有可能分析物无法分离，造成成分的不确定因素，此外，血液是体内样本，分析物往往需要内标物校正，而内标物最好的选择是相应同位素的化合物，但是柱前衍生化法不适合分析同位素样品。

2 液相色谱－质谱联用法

传统分析氨基酸采用柱前衍生化和柱后衍生化分析方法，使其生成具有紫外或荧光基团的衍生化合物后进行检测。但是方法操作复杂繁琐、内外影响因素较多、耗费时间较长，费用较高，给临床血液样本检测带来了极大的不便，技术难以推广应用。

新兴的各种串联质谱技术的出现，广泛地运用到各种大分子和小分子化合物的检测，从传统的方法中脱颖而出，并应用到医学领域，如临床诊断治疗、药物分析等各个分支学科。在HPLC－MS/MS分析中，研究者们同样采用衍生化法分析氨基酸，虽然缺乏特异性，但极大地缩短了分析时间，而且灵敏性高。Yohei 等［15］通过HPLC－MS/MS 方法和衍生化技术在20 min 内完成了21 种氨基酸的定量，LOD达到了5.1fmol。Shimbo 等［16］采用APDS(3－aminopyridyl－N－hydroxysuccinimidyl carbamate)柱前衍生化22 种哺乳动物血浆氨基酸后，通过HPLC/ESI－MS/MS 在10 min 之内完成分析定量。无论是从分离性能上，还是从分析时间和灵敏度上比较，HPLC－MS/MS 都要比传统的HPLC、氨基酸分析仪等都要优越。

由于衍生化技术的操作复杂、耗时性以及缺乏特异性，无法适用于临床血样样本的高通量分析。近年来研究者们通过不断的研究与探索，采用挥发性离子对试剂，如七氟丁酸(Heptafluorobutyric Acid，HFBA)、九氟戊酸(Nonafluorovaleric Acid，NFVA)、全氟庚酸(Tridecafluoroheptanoic acid，TDFHA)等，不需要对氨基酸进行衍生化就可以对其进行直接分析，简单、快速、准确的高效液相色谱－串联质谱法逐渐开始在复杂生物基质中氨基酸分析发挥主导地位。Zoppa 等［17］研究一种HPLC－ESI－MS/MS 定量或定性分析新生儿干燥血点的氨基酸，不需要衍生化试剂，直接在流动性中添加TDFHA，在10min 之内就分析完40 种氨基酸以及同分异构体。Le 等［12］在流动相水相系统添加1mmol/L TDFHA，开发了一种快捷而灵敏的UPLC－MS/MS 定量法，分析33 种血浆氨基酸只运行了10min，并且与氨基酸自动分析仪对比拟合分析，线性拟合度达到R2＞0.96 以上，可以完全替代传统的氨基酸分析仪。与传统的方法相比，结合离子对试剂分析氨基酸，LC－MS/MS 技术具有高特异性，高灵敏性和高通量分析的优势(见表1)，为临床分析生物标志物的探索、解说疾病的机理等提供了良好的技术平台。

表1 氨基酸检测方法对比Table 1 Comparison of detective methods of amino acids analysis

3 血液中氨基酸检测的临床应用

现代生物医学观点认为，疾病在本质上是一个从基因失调开始，经表达异常、代谢异常、功能失调、机构改变直至产生临床表现的生化改变过程。一旦出现临床症状、体征或形态结构改变，疾病实际上已处于发生发展的终末阶段。代谢是机体最为重要的一环，特征代谢物的出现或者改变一般要远远早于传统的病理学终点。在生化分子发生变化的阶段，并未检测到任何组织病理学的改变前，此时对疾病进程的干预使得疾病的治愈有极大的可能性。血液氨基酸在体内维持着一个动态平衡体系，是机体代谢重要的一环，很多代谢疾病，如肿瘤、糖尿病、肝病、前列腺癌、肾毒性等都会导致氨基酸代谢紊乱。Yuan 等［18］运用HPLC 测定帕金森病(Parkinson’s Disease，PD)的血液神经递质类氨基酸时发现，在疾病的早期门冬氨酸、谷氨酸、牛磺酸、丝氨酸和谷氨酸与γ－氨基丁酸的比值呈显著下降的趋势，有助于早期预测帕金森病。Nagata等［19］通过液质串联质谱分析日本妇女绝经前的血浆氨基酸图谱，提出精氨酸、亮氨酸、酪氨酸、门冬氨酸的紊乱能够评估乳腺癌发生的风险率。Magnusson［20］等采用HPLC－MS/MS 连续12 年监测心血管患者血液中氨基酸，发现异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸的含量变化在预测糖尿病的同时也可以预测心血管疾病。

4 结语

血液中的氨基酸是代谢组学中最重要的一个环节，因此监测其含量可以辅助临床诊断或提供重要的疾病分析依据。目前为止，检测氨基酸的方法众多且都具有各自的特点，选择适合的检测方法一直倍受到医学界的重视。新兴的高效液相色谱－质谱联用技术具有快捷、准确、高灵敏性、高特异性及高通量的优势，将成为临床分析氨基酸以及其它代谢疾病分子的主流。

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