丹参联合参附注射液对大鼠重症胰腺炎肾脏NF-κB 调控的研究

杨胜波， 丁宪群， 牛 刚， 张 建， 杨媛媛

(1. 贵阳中医学院第二临床医学院，贵州 贵阳550001;2. 贵阳中医学院第二附属医院，贵州 贵阳550001)

重症急性胰腺炎(severe acute panereatitis，SAP)是胰腺组织自身消化为基础与胰腺自身的坏死为主要特征的全身性疾病，可以引起局部和全身性的过度炎症反应，造成血管渗出、低血容量、休克及多脏器功能障碍等系统性炎症反应综合征(SIRS)，甚至可以导致多器官功能衰竭(MODS)。其中，肾功能障碍的发生率仅次于肺功能障碍，大约占50%［1］，当疾病发展到肾功能衰竭后，导致与其相关脏器衰竭的发生率也明显上升。目前，胰腺炎发病机制并不完全明确，研究其发生与发展有关的通路及信号分子已经成为热点。其中，核转录因子-κB (NF-κB)就已经成为研究的焦点。目前，NF-κB 已被证实在SAP 中表达量增加，由此可推断该因子在SAP 发生、发展中扮演着重要的角色［2］。丹参和参附注射液具有抑制炎症并改善微循环等功能，基于此，本实验采用丹参联合参附注射液干预SAP大鼠肾损害模型，观察其肾组织NF-κB 及血清Cr、BUN 的变化，旨在探讨丹参和参附注射液可能的作用机制，为该药在临床上的运用提供理论依据。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料 清洁级成年健康SD 大鼠72 只(第三军医大学实验动物中心，合格证号SCXK (渝)2014-005)。参附注射液(雅安三九药业有限公司，批号131023010);丹参注射液(正大青春宝公司，批号1405133);牛黄胆酸钠(Sigma 公司);NF-κB/P65 (L523)亚单位一抗(Bioworld Technology 公司)。全自动生化分析仪(贵阳中医学院第二附属医院检验科)。

1.2 实验方法

1.2.1 SAP 大鼠模型的建立［3］72 只SD 大鼠术前12 h 禁食，但予以自由饮水。水合氯醛麻醉后，脱毛膏腹部脱毛、固定、消毒，正中切口入腹，从肝十二指肠韧带肝门侧用小动脉夹暂时夹闭胆胰管，4 号针头由十二指肠前壁处进针，经乳头部插入胆胰管内，以0.2 mL/min 的速度向胆胰管内推注5%牛磺胆酸钠(0.1 mL/100 g)，见胰胆管扩张后将针头拔出，并加压阻塞胆胰管进入十二指肠的开口，2 min 后解除加压，可见胰腺组织迅速出现水肿、充血、沿血管壁两侧出现发红、片状紫红、或点状，取下小动脉夹并予以关腹。术后可自由饮水、禁食。

1.2.2 药物干预SAP 大鼠模型 丹参联合参附注射液治疗组建模后立即由尾静脉缓慢注射，丹参和参附注射液各0.2 mL/100 g［4］，假手术组、SAP 模型组予以注射等体积的生理盐水。

1.2.3 标本采集 药物干预6、12、24 h 后予以麻醉，由原切口开腹，腹腔静脉采取血液送检;取胰腺及左肾标本，观察组织大体颜色、形态，并将其分别放于10%甲醛液中待作苏木素-伊红染色镜检，取右肾于80 ℃冰箱保存，待行免疫组织化学法检测NF-κB 的表达。

1.2.4 统计学处理 各组实验均采用SPSS 17.0 统计软件。计量资料采用±s 表示，组间资料比较采用ANOVA和t 检验，P ＜0.05 具有统计学意义。

2 结果

2.1 SAP 模型大鼠肾脏组织NF-κB 蛋白的表达 模型建立成功后，SAP 模型组肾脏NF-κB 的表达随着时间的推移逐渐升高，在24 h 达到高峰，而SAP 丹参联合参附治疗组与其比较则有明显的下降(P ＜0.01);假手术组NF-κB 的表达随着时间的推移无明显的变化(P ＞0.05);SAP 模型组与其他两组相比较，NF-κB 的表达明显增高(P ＜0.01)。提示丹参联合参附注射液能够抑制使SAP 模型大鼠肾损害肾脏NF-κB 的表达，见表1。

表1 SAP 模型大鼠肾脏组织NF-κB 蛋白的表达积分光密度(IOD)的变化(±s，n=8)

表1 SAP 模型大鼠肾脏组织NF-κB 蛋白的表达积分光密度(IOD)的变化(±s，n=8)

注:SAP 模型组与假手术组比较，* P ＜0.01;SAP 模型组与丹参联合参附注射液治疗组比较，Δ P ＜0.01;同组各时相比较，ψ P ＜0.01，下表同

组别 NF-κB 积分光密度(IOD)6 h 12 h 24 h假手术组7.46 ±0.550 7.26 ±0.833 7.33 ±0.815 SAP 模型组 31.58 ±3.805* 45.30 ±3.537* ψ 56.79 ±3.500* ψ丹参联合参附注射液治疗组 19.76 ±2.206Δ 30.41 ±3.314Δψ 40.89 ±3.435 Δψ

2.2 SAP 模型大鼠血清BUN、Gr 的变化 模型建立成功后，SAP 模型组血清Gr、BUN 随着时间的推移逐渐升高，在24 h 达到高峰，而SAP 丹参联合参附治疗组与其比较则有明显的下降(P ＜0.01);假手术组血清Gr、BUN 随着时间的推移无明显的变化(P ＞0.05);SAP 模型组与其他两组相比较，血清Gr、BUN 明显增高(P ＜0.01)。提示丹参联合参附注射液能够使SAP 模型大鼠肾损害血清Gr、BUN明显下降，见表2。

表2 SAP 模型大鼠药物干预后不同时间血清Gr、BUN 的变化(±s，n=8)

表2 SAP 模型大鼠药物干预后不同时间血清Gr、BUN 的变化(±s，n=8)

组别 血清Gr/(mmol·L -1)血清BUN/(μmol·L -1)6 h 12 h 24 h 6 h 12 h 24 h假手术组 45.3 ±3.73 45.1 ±4.55Φ 45.6 ±3.62Φ 5.6 ±0.93 6.09 ±1.12Φ 5.8 ±1.10 Φ SAP 模型组 70.4 ±5.83* 90.9 ±5.72* ψ 127.1 ±5.99* ψ 9.9 ±0.91* 16.4 ±1.03* ψ 21.8 ±1.77#ψ丹参联合参附注射液治疗组 61.2 ±4.65#Δ 78.4 ±5.21#Δ Ω 94.1 ±5.00#Δ Ω 7.6 ±1.06#Δ 11.1 ±0.86#Δ Ω 17.2 ±1.10#Δ Ω

2.3 胰腺组织、肾组织苏木素-伊红染色 胰腺组织、肾组织通过苏木素-伊红染色后假手术组胰腺组织HE 染色显示，组织结构正常，肾脏无水肿、出血及坏死;SAP 丹参联合参附治疗组胰腺间质局部出血，肾脏肾组织间质出血，部分肾小球结构破坏;SAP 模型组胰腺腺泡结构破坏，有大片坏死灶，间质水肿，胰腺间质大量中性粒细胞浸润，肾脏肾小球结构破坏、间质水肿，中性粒细胞浸润，见图1、图2。

图1 胰腺组织苏木素-伊红染色(×200)

图2 肾脏组织苏木素-伊红染色(×200)

3 讨论

重症急性胰腺炎是临床比较多见的且较为凶险的疾病，病死率可以达到30% ～40%［5］，急性肾功能损害是SAP 严重的的并发症之一。国外相关报道提示SAP 合急性肾功能损害的死亡率高达63%，而国内相关报道则为50%左右［6-7］。

SAP 发病机制目前认为是胆石的阻塞为主要诱因之一，胆石阻塞后导致胰液流出道严重受阻，胆汁逆流进入胰管，胰管内压力不断上升，进而造成腺泡及胰管的破坏而导致SAP 发生。SAP 发生后胰腺可以释放较多的血管活性多肽具有较强的肾毒性作用。随着胰蛋白酶的明显增加，可明显激活肾素-血管紧张素系统，从而启动肾小球的血管收缩，导致肾小球动脉压下降［8］，蛋白溶解酶可进一步导致肾小球的通透性增加，继发肾小管和肾间质的损害，最终导致急性肾功能衰竭的发生。

核转录因子κB (NF-κB)是一种广泛存在于人体组织和细胞中的核转录因子，主要参与调节机体炎症、胚胎发育、组织损伤和修复等相关的基因表达［9-10］。相关研究显示，多种炎性因子如IL-1、TNF-ɑ、IE 等启动子或者增强子基因中存在κB 的相关序列，而NF-κB 可诱导相关炎性介质的产生，从而激活相关基因及早期炎症反应基因，产生较多的炎症因子［11］。Gukovsky 等［12］在SAP 动物模型中发现建模30 min 后即有NF-κB 较高的表达，并指出NF-κB 的高表达在急性胰腺炎的炎性反应中至关重要，可以引起SAP胰腺组织中炎性介质的释放增加。SAP 的发生、发展，NFκB 的活化成为其发病的使动作用。另外，炎性因子的大量释放，又可以调剂NF-κB 的进一步活化，从而导致SAP 发生、发展进入恶性循环。由此可见，NF-κB 的活化在SAP疾病发生、发展过程中诱导大量的炎性因子参与，从而导致胰腺出现严重的病理生理的改变，进而出现一系列的临床表现。

中医认为丹参具有活血通络、凉血消痈、祛瘀止痛等功效，近年来，大量的临床研究表明，丹参具有扩张微血管和改善微循环等临床作用，朱颖炜等［13］临床观察结合应用丹参注射液治疗可以减少SAP 并发症的发生率，且能降低死亡率和缩短疗程，提高治愈率;刘明东等［3］认为丹参能抑制内毒素引起的促炎递质如一氧化氮(NO)、TNF-α，IL-1β 等的产生。而参附注射液具有回阳救逆，益气固脱的功效，主要用于阳气暴脱的厥脱症，中医认为气能摄血，气能行血，初云海等［14］研究表明参附注射液能改善肾血流灌注机制保护肾损伤，并且具有通过抑制脂质过氧化反应，从而达到减轻自由基损伤。故本实验选用丹参联合参附注射液作为实验用药。

本实验采用胆胰管逆行注射牛磺胆酸钠诱导大鼠SAP模型。建模成功后可观察到胰腺组织充血水肿，甚至出现点状、片状的出血灶，同时可观察肾脏充血水肿等;而光镜下可见胰腺腺泡被破坏，间质出现水肿，甚至出血，且有大量粒细胞聚集浸润;同时肾间质出现水肿出血，粒细胞浸润，部分肾小球破坏。模型组与假手术组比，NF-κB的表达增加，血清肌酐、尿素氮均升高;SAP 丹参联合参附治疗组与SAP 模型组相比，NF-κB 蛋白的表达以及血清Cr、BUN 减少，而光镜下可见丹参联合参附治疗组胰腺、肾脏组织炎症较SAP 模型组明显减轻。说明丹参联合参附注射液能够抑制SAP 大鼠肾脏组织的NF-κB 的表达，抑制炎症反应的发生，有效控制血清Cr、BUN 的水平，从而达到治疗SAP 及保护肾功能的作用。

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