UPLC 法测定地黄叶及块根中的梓醇和毛蕊花糖苷

王娟娟， 张振凌 ， 都盼盼， 孙翼飞

(河南中医学院，河南 郑州450003)

地黄叶为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch 的叶，《食疗本草》记载，地黄叶性微苦、寒，入肝经，有解毒疗疮功效，可治恶疮和手足癣，外用捣汁涂抹或揉搓［1］。另外，它还被收载于《北京市中药材标准》1998 年版［2］，具有益气养阴、补肾、活血的作用。环烯醚萜苷类化合物梓醇和苯乙醇苷类化合物毛蕊花糖苷是地黄药材质量评价的指标性成分，现代药理研究表明，梓醇具有神经保护、降血糖、利尿、缓泻、抗癌、抗炎等作用［3-5］;毛蕊花糖苷具有雄性激素样作用［6］，以及抗氧化、抗肿瘤、增强心血管活性等功能［7］。传统HPLC 法测定地黄中梓醇和毛蕊花糖苷的含有量时，存在分析时间长［8］、两种成分间易出现容积峰［9］等问题，而本实验首次采用UPLC 法对两者同时进行测定，可提高分析效率，节省分析时间，减少溶剂损耗。而且，关于不同月份地黄叶中梓醇的积累动态情况虽已有研究［10-11］，但同一时期不同部位地黄叶中梓醇及毛蕊花糖苷的含有量却尚未见报道。因此，本实验对不同部位鲜地黄叶中这两种化学成分的含有量进行测定，并与鲜地黄块根和存放一年的干地黄叶加以比较，为进一步综合开发利用该植物资源提供参考和依据。

1 仪器与材料

安捷伦1290 液相色谱仪，包括DAD 检测器(美国安捷伦公司);HH-6 数显恒温水浴锅(上海比朗仪器有限公司);BS210S 型电子天平(万分之一，德国赛多利斯公司);AE 240 型电子天平(十万分之一，瑞士Mettler-Toledo 公司)。

毛蕊花糖苷和梓醇对照品(中国食品药品检定研究院，纯度分别以94.4%和98.1%计，批号分别为111530-201411 和110808-201210)。药材采自河南中医学院新校区药园，经河南中医学院董诚明教授鉴定为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch 的叶和块根。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 ACQUITY UPLC BEH Shield RP18色谱柱(2.1 mm ×100 mm，1.7 μm);流动相为乙腈 (A)-0.1% 磷酸水溶液 (B)，梯度洗脱(0 ～10 min，0%～18%A;10 ～20 min，18%～22%A);体积流量0.2 mL/min;柱温35 ℃;检测波长210 nm;进样体积4 μL。

2.2 对照品溶液的制备 取梓醇和毛蕊花糖苷对照品适量，加2%乙腈溶解，摇匀，即得(质量浓度分别为0.22 和0.029 mg/mL)。

2.3 供试品溶液的制备 取鲜地黄叶和块根适量，洗净后擦干，分别切成约2 ～4 mm 的小块。然后，精密称取其中1.0 g，置于锥形瓶中，加入甲醇50 mL，加热回流提取1.5 h，放冷后用甲醇补足减少质量，摇匀，过滤。再精密吸取续滤液2 mL，浓缩蒸干，残渣用2%乙腈溶解，转移至5 mL 量瓶中，并用2%乙腈稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.4 线性关系的考察 分别精密吸取梓醇和毛蕊花糖苷对照品溶液1.0 mL，稀释后置于5、10、50、100、250 mL 量瓶中，加2%乙腈至刻度，摇匀，进样10 μL，重复3 次，记录色谱图。再以进样量(μg)为横坐标(X)，峰面积积分值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线并进行回归分析，计算出回归方程及检测范围。结果，梓醇的回归方程为Y=5 082.1 X-14.689，r=1，检测范围0.008 8 ～2.2 μg;毛蕊花糖苷的回归方程为Y=39 549 X +26.826，r=0.999 9，检测范围0.001 16 ～0.29 μg。

2.5 精密度试验 取“2.3”项下干地黄叶供试品溶液适量，连续进样6 次测定。结果，梓醇和毛蕊花糖苷的RSD 分别为0.78%和0.93%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取干地黄叶适量，按“2.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液进行测定。结果，梓醇和毛蕊花糖苷的RSD 分别为1.16% 和1.35%，说明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 取“2.3”项下干地黄叶供试品溶液适量，分别于0、2、4、6、10、12 h 进样测定。结果，梓醇和毛蕊花糖苷的RSD 分别为0.87% 和1.15%，表明供试品溶液在12 h 内稳定。

2.8 加样回收率试验 取干地黄叶6 份，每份约0.5 g，精密加入毛蕊花糖苷和梓醇对照品溶液各1 mL (质量浓度分别为4.911 和7.734 mg/mL)，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，并测定其含有量，结果见表1 和表2。由表可知，该方法加样回收率良好，而且准确可靠。

表1 梓醇加样回收试验结果Tab.1 Result of recovery tests for catalpol

表2 毛蕊花糖苷加样回收试验结果Tab.2 Result of recovery tests for verbascoside

2.9 样品测定 按“2.3”项下方法，制备同一批次鲜地黄块根、嫩叶、老叶、干地黄叶的供试品溶液，每批测定3 次，取峰面积平均值，代入回归方程计算。然后，根据水分测定结果，将其换算成干燥品中的含有量，结果见图1 和表3。

表3 地黄各部位中梓醇和毛蕊花糖苷的测定结果Tab.3 Determination result of catalpol and verbascoside in different parts of Rehmannia glutinosa Libosch

图1 混合对照品、老叶、嫩叶、块根和干叶的UPLC 图Fig.1 UPLC of mixed reference substances，matured leaves，tender leaves，root tubes and dried leaves

从实验结果来看，地黄叶中梓醇和毛蕊花糖苷的含有量比块根更多，并且不同部位地黄叶中梓醇的含有量差别明显，但毛蕊花糖苷的含有量差别较小。另外，地黄叶存放一年后，毛蕊花糖苷的减少量比梓醇小，表明前者稳定性高于后者。

3 讨论

本实验采用UPLC 法，对地黄叶中梓醇和毛蕊花糖苷的含有量同时进行测定，该方法比HPLC 法更简便迅速，既改善了色谱峰的分离度和检测灵敏度，又明显提高分析速度，减少溶剂消耗。《中国药典》2010 年版［12］中梓醇和毛蕊花糖苷的检测波长分别为210 和334 nm，而在预实验中发现，梓醇在334 nm 波长下几乎无吸收，而毛蕊花糖苷在波长210 nm 下也基本没有改变，与文献［8］ 报道一致，故选择210 nm 作为检测波长。另外，本实验还考察了乙腈-水、乙腈-0.1% 磷酸、乙腈-0.1%醋酸水溶液这3 种流动相系统，25、30、35℃这3 种柱温，0.1、0.2、0.3 mL/min 这3 种体积流量以及不同的梯度条件，发现在本实验条件下，所测成分的色谱峰分离效果和峰型较好。同时，参照《中国药典》中地黄供试品的制备方法，还研究了提取溶剂(水、纯甲醇、50%甲醇)、方法(超声、加热回流)和时间(0.5、1、1.5 h)，结果显示《中国药典》中的方法，即纯甲醇加热回流1.5 h 时，提取效果最佳。

在供试品的制备过程中，将鲜地黄叶和块根洗净擦干，切成2 ～4 mm 小块后直接测定含有量和水分，并将水分换算成干燥品中的含有量。该方法能尽量避免干燥过程对有效成分的破坏，能更确切地反应梓醇和毛蕊花糖苷的含有量［10］。另外，水分测定结果显示，鲜地黄块根中的水分含有量约为85%，而不同部位地黄叶中的水分含有量变化不大，均为90%左右，但干地黄叶中的水分含有量较低，仅约为9%。

梓醇为环烯醚萜苷类化合物，其化学性质活泼，易被水解和氧化，稳定性差［13-15］。在同一时期地黄叶中，嫩叶的梓醇含有量较高，约为老叶的3 倍，但在存放一年的干地黄叶中，其含有量明显下降，可能受温度、湿度等贮藏条件的影响较大，也与环烯醚萜苷类成分的不稳定性有关。虽然地黄老叶中毛蕊花糖苷的含有量略高于嫩叶，但存放一年后，其减少量比梓醇更小。《中国药典》2010 版将毛蕊花糖苷作为熟地黄的质量控制指标，其含有量限度与生地黄相同，均不得少于0.02%，结合本实验结果，可认为毛蕊花糖苷的稳定性高于梓醇［16］。另外，在不同部位的地黄叶中，这两种成分的含有量均明显高于鲜地黄块根，说明对地黄叶进行综合开发利用将具有很大的价值。

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