HPLC 法同时测定加味香连丸中芍药苷、柚皮苷、橙皮苷和黄芩苷

李 想， 卢静华

(辽宁医学院，辽宁 锦州121000)

加味香连丸收载于《中国药典》2010 年版一部，由黄柏、木香、黄芩、黄连、枳壳、白芍、当归、厚朴、槟榔、延胡索、吴茱萸、甘草12 味中药组成，具有清热祛湿、化滞止痛的作用。临床主要用于大肠湿热所致的痢疾，症见大便脓血、腹痛下坠、里急后重［1］。其中芍药、黄芩和枳壳均为主要药味。白芍养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳，用于血虚萎黄、月经不调、自汗、盗汗、胁痛、腹痛、四肢挛痛、头痛眩晕［2］。芍药苷是白芍的主要成分之一。黄芩具有清热燥湿、泻火解毒、凉血止血、除热安胎等功效，用于湿热泻痢、肺热咳嗽、热病烦渴、黄疸、目赤肿痛、积热吐血、胎动不安等症［3-6］。黄芩苷是黄芩的主要成分之一。枳壳有理气宽中、行滞消胀的功能，主要用于胸胁气滞、胀满疼痛、食积不化、痰饮内停、脏器下垂［7-11］。柚皮苷、橙皮苷是枳壳的主要成分。目前《中国药典》2010 年版只收载了高效液相色谱法测定加味香连丸中盐酸小檗碱的含有量。为满足对复杂中成药质量控制要求，本实验选取了芍药苷、柚皮苷、橙皮苷和黄芩苷作为检测指标，建立高效液相同时测定这4 种成分的方法以有效控制产品的质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器 KQ-100A 型超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司);L-2000 高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器(日本日立公司);无油真空泵(上海科尔达制泵有限公司);YOKO-ZF 三用紫外分析仪(武汉药科新技术开发有限公司);TD 型电子天平(德国赛多利斯股份公司);1810-B 型石英自动双重水蒸馏器(江苏宏华仪器厂)。

1.2 试药 对照品柚皮苷(批号110722-201108)、黄芩苷 (批号110715-201104)、橙皮苷 (批号11021-201212)均购自中国食品药品检定研究院。加味香连丸(北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，批号分别为2083019、4082033、3081091)。甲醇、乙腈均为色谱纯;磷酸为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用 Hypersil ODS 色谱柱(4.6 mm×200 mm，5 μm);以乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)为流动相，梯度洗脱 (0 ～20 min，10% ～15% A;20 ～30 min，15% ～20% A;30 ～50 min，20% ～22% A;50 ～55 min，22% ～23% A);体积流量1.0 mL/min;检测波长274 nm;柱温25 ℃;进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 供试品溶液的制备 取适量加味香连丸，置于研钵中研成细粉，精密称定约0.2 g 粉末，置于锥形瓶中。加入50 mL 甲醇，密闭条件下放置24 h，称定质量，超声30 min，放冷，再称定质量，减失质量用甲醇补足，摇匀，抽滤，用0.45 μm 的滤膜过滤，取续滤液，即得［12-14］。

2.2.2 混合对照品贮备液的制备 分别取芍药苷、柚皮苷、橙皮苷和黄芩苷0.80 mg、5.2 mg、1.7和3.3 mg，精密称定，置于同一25 mL 量瓶中，加入适量甲醇并定容，摇匀，制得质量浓度分别为0.032、0.208、0.068、0.132 mg/mL 的混合对照品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 按原处方制备不含白芍药材、枳壳药材和黄芩药材的阴性样品，并按“2.2.1”项下制备工艺分别制成不含芍药、麸炒枳壳和黄芩的阴性供试品及阴性样品溶液。

2.3 系统适用性试验 分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液和阴性样品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，测定峰面积，芍药苷、柚皮苷、橙皮苷和黄芩苷的峰与其他峰均可达到基线分离，样品中其他成分不干扰测定，保留时间适中，见图1。

2.4 线性关系考察 精密量取0.1、0.2、0.4、0.6、1.2、2.4 mL“2.2.2”项下的混合对照品贮备液，分别置于不同的10 mL 量瓶中，加入甲醇定容。在“2.1”项下色谱条件进样分析，以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，计算线性回归方程，得到芍药苷、柚皮苷、橙皮苷和黄芩苷的回归方程分别为Y = 1.12 × 104X +0.59 ×103(r =0.999 8)，线性范围0.32 ～7.68 μg/mL;Y=1.26 ×104X+6.62 ×103(r=0.999 8)，线性范围2.08 ～49.92 μg/mL;Y =1.34 ×104X +1.88 ×103(r =0.999 7)，线性范围0.68 ～16.32 μg/mL;Y=2.35 ×104X-1.02 ×104(r=0.999 8)，线性范围1.32 ～31.68 μg/mL。

图1 加味香连丸中芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷的色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of paeoniflorin，naringin，hesperidine and baicalin in Jiawei Xianglian Pills

2.5 方法学考察

2.5.1 重复性试验 取同一供试品溶液(n =6)，在“2.1”项下色谱条件进样分析，计算芍药苷、柚皮苷、橙皮苷和黄芩苷色谱峰面积的RSD 分别为0.92%、0.76%、0.84% 和1.4%，结果表明，本方法重复性良好。

2.5.2 精密度试验 取同一质量浓度的混合对照品，在“2.1”项下色谱条件连续进样6 次，并计算芍药苷、柚皮苷、橙皮苷和黄芩苷色谱峰面积的RSD 分别为0.61%、0.37%、0.79%和1.3%，结果表明，仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液(批号2083019)，分别于0、2、4、8、12、24 h 按“2.1”项下色谱条件进样分析。结果芍药苷、柚皮苷、橙皮苷和黄芩苷的RSD 分别为1.1%、0.64%、0.79%和1.1%，表明样品中4 种成分在室温下放置24 h 基本稳定。

2.5.4 加样回收试验 分别取0.1 g 含有量已知的同一批次(批号2083019)加味香连丸样品粉末9 份，按低(含芍药苷0.043 2 mg/mL、柚皮苷0.592 4 mg/mL、橙皮苷0.130 4 mg/mL、黄芩苷0.289 6 mg/mL)、中(含芍药苷0.054 7 mg/mL、柚皮苷0.7488 mg/mL、橙皮苷0.174 8 mg/mL、黄芩苷0.355 2 mg/mL)、高 (含芍药苷0.066 2 mg/mL、柚皮苷0.883 6 mg/mL、橙皮苷0.205 6 mg/mL、黄芩苷0.425 4 mg/mL)3 种加入量分别精密加入混合对照品溶液各1 mL，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，测定，计算结果见表1。

2.6 样品测定 取本品3 批，按“2.2.1”项下方法操作，制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，用外标法计算加味香连丸中芍药苷、柚皮苷、橙皮苷和黄芩苷的含有量，结果见表2。

3 讨论

在200 ～400 nm 波长处进行紫外扫描，芍药苷在230 nm 有最大吸收，柚皮苷和橙皮苷在284 nm处有最大吸收，黄芩苷在274 nm 处有最大吸收，根据此3 种波长下色谱图比较，应选用274 nm 为检测波长，分离度较好，干扰小。

采用Hypersil ODS 色谱柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)和Hypersil BDS 色谱柱 (4.6 mm × 200 mm，5 μm)进行试验，BDS 色谱柱出峰时间较早，但分离度和响应度较ODS 色谱柱差，故选用ODS 色谱柱进行测定。

曾选用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%磷酸水为流动相，乙腈为流动相时，出峰时间较甲醇早，且前后峰之间的分离度较好。加入0.2%的磷酸水溶液后，前延峰和拖尾峰能得到较好分离，峰形较好。因此选用乙腈-0.2%磷酸水作为流动相。

《中国药典》2010 年版中收录了加味香连丸中盐酸小檗碱的定量测定作为质量标准，现有文献中也只有对加味香连丸中厚朴、厚朴酚、木香烃内酯、去氢木香内酯及芍药苷的测定，而对于含有较多味中药材的中成药来说，需要检测其中多种药材中成分的含有量以便更好地控制该产品的质量。本实验采用HPLC 法同时测定加味香连丸中芍药苷、柚皮苷、橙皮苷和黄芩苷4 种黄酮类成分，方法简便、可靠、准确，重复性和稳定性较好，为加味香连丸的质量控制提供了更为可靠的依据。

表1 加样回收率测定结果Tab.1 Result of recovery tests

表2 样品测定结果(±s，n=3)Tab.2 Result of determination of samples (±s，n=3)

表2 样品测定结果(±s，n=3)Tab.2 Result of determination of samples (±s，n=3)

批号 芍药苷/(mg·g -1)柚皮苷/(mg·g -1)橙皮苷/(mg·g -1)黄芩苷/(mg·g -1)7 3.57±0.016 1 4082033 0.47±0.005 2 6.69±0.034 1 1.64±0.007 5 3.03±0.025 5 3081091 0.51±0.006 4 7.29±0.031 3 1.77±0.010 2083019 0.55±0.005 0 7.41±0.019 3 1.70±0.003 7 3.96±0.015 0

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