淡豆豉异黄酮对大鼠成骨细胞增殖及雌激素受体表达的影响

李 琛， 师 哲， 冯 薇， 牛丽颖， 王鑫国*

(1. 河北中医学院中药药理实验室，河北 石家庄050091;2. 邢台市人民医院药剂科，河北 邢台054000)

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是严重威胁中老年人群，尤其是绝经后女性的一种全身性骨代谢疾病，研究表明雌激素缺乏是绝经后妇女骨丢失的重要原因［1］。异黄酮类植物雌激素因其具有与内源性雌激素相似的结构，但少有雌激素样副作用的发生，在防治绝经后骨质疏松症的研究中备受关注。中药淡豆豉是由豆科植物大豆Glycine max(L.)Merr. 的成熟种子(黑色者)和青蒿、桑叶经发酵加工而成，主要有效成分为异黄酮类。课题组前期体内实验采用大鼠去卵巢的方法模拟妇女绝经后骨质疏松，发现淡豆豉能够纠正骨质疏松大鼠骨组织形态计量学参数的异常，改善骨微细结构及骨生物力学性能，提高骨质量［2-3］，但其作用机制尚不明确。现代研究发现，雌激素受体(estrogen receptor，ER)对调控骨形成和骨吸收的平衡有着重要作用，其表达水平与骨质疏松症密切相关。本研究以淡豆豉异黄酮为研究对象，观察淡豆豉异黄酮对大鼠成骨细胞(osteoblasts，OB)增殖及ERβ表达变化的影响，为淡豆豉抗骨质疏松机制的研究提供实验依据。

1 材料

1.1 动物 出生24 h 以内SD 大鼠，购自河北省实验动物中心(合格证号1112001)。

1.2 药物与试剂 淡豆豉异黄酮，由本实验室自行分离纯化，工艺为淡豆豉药材用石油醚(60 ～90℃)脱脂，将脱脂后的淡豆豉用8 倍量70% 乙醇回流提取3 次，每次2 h，合并提取液回收乙醇，浓缩至每1 mL 含0.225 g 生药。将0.225 g 生药/mL 的浓缩液调pH 4.5 作为上样液，以1.125 g 生药/mL树脂的最大上样量，4 BV/h 的上样流量通过ADS-7 大孔吸附树脂，先用5 BV 水洗脱，继以8 BV 70% 乙醇4 BV/h 洗脱，收集洗脱液，置减压干燥箱中烘至完全干燥，取出，粉碎成80 目粉末，即得，紫外分光光度法测定总异黄酮含有量为40%。将淡豆豉异黄酮以DMSO 配制100 g/L 的母液，临用前用无血清DMEM 培养液稀释至相应工作浓度;大豆异黄酮，本实验室自制，总异黄酮含有量50%，配制方法同上。17β-雌二醇、ICI 182780(美国Santa Cruz 公司);低糖DMEM (美国Gibco公司);胎牛血清(美国Hyclone 公司);胰蛋白酶、MTT (美国Amresco 公司);胶原酶Ⅱ(美国Invitrogen 公司);RT-PCR 试剂盒(天根生化科技北京有限公司);PCR 引物由上海生物工程有限公司合成，序列为ERβ (317 bp)正向引物5'-TGCCAATCATCGCTCCTCTA-3'，反向引物5'-CGCCGGTTCTTGTCTATGGT-3';GAPDH (450 bp)正向引物5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，反向引物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。ERβ Rabbit mAb (美国Santa Cruz 公司);HRP 标记的山羊抗兔IgG (北京中杉金桥生物技术有限公司);Rabbit Anti-β-Actin (北京博奥森生物技术有限公司);ECL 发光检测试剂盒(美国Pierec 公司);其余试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 主要仪器 KHB ST-360 酶标分析仪(上海科华生物工程股份有限公司);MCO-15AC CO2培养箱(日本三洋公司);Motic AE 倒置显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司);PCR 仪(德国Eppendorf公司);电泳仪、电泳槽(北京六一生物科技有限公司);FR-200A 凝胶扫描系统(上海复日科技有限公司)。

2 方法

2.1 大鼠成骨细胞的分离、培养及鉴定 参照文献［4］，采用改良组织块法分离培养新生SD 大鼠颅骨成骨细胞。用含10% 胎牛血清的DMEM 培养液(青霉素1 ×105U/L，链霉素1 ×105U/L，pH 7.2 ～7.4)进行传代，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。细胞传至第5 代，通过细胞形态学观察及碱性磷酸酶染色鉴定(使用南京建成cAKP 试剂盒，按说明书步骤操作)，5 ～6 代细胞用于实验。

2.2 成骨细胞增殖能力测定(MTT) 实验分为空白对照组，1、10、100、1 000 μg/L 淡豆豉异黄酮组，淡豆豉异黄酮(1 000 μg/L) + ICI 182780(10 nmol/L)组(ICI 182780 于淡豆豉异黄酮干预前2 h 进行孵育)，1 nmol/L 17β-雌二醇(E2)组，1 000 μg/L 大豆异黄酮(ISO)组。细胞传至第5代，调整细胞密度为5 ×107个/L，接种至96 孔培养板，药物干预，分别于48 h 和72 h 吸除培养液，每孔加入100 μL 无血清DMEM 培养液和20 μL MTT (5 g/L)，继续孵育4 h，吸弃培养基上清，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，用酶标仪在492 nm 处检测OD 值。

2.3 淡豆豉异黄酮对成骨细胞ERβ mRNA 及蛋白表达的影响

2.3.1 RT-PCR 检测不同质量浓度淡豆豉异黄酮干预后成骨细胞ERβ mRNA 表达 实验分为空白对照组，1、10、100、1 000 μg/L 淡豆豉异黄酮不同质量浓度组。细胞接种、药物干预72 h，Trizol法提取成骨细胞总RNA;将RNA 反转录成cDNA，进行PCR 扩增。ERβ 扩增条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共30 个循环，最后72 ℃延伸5 min;GAPDH 扩增条件同ERβ。反应产物4 ℃保存。扩增产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳，用Quantity One 图像分析系统检测各组ERβ 及GAPDH 电泳带的光密度值，以两者之比代表ERβ mRNA 的相对表达量。

2.3.2 Western blot 检测不同质量浓度淡豆豉异黄酮干预后成骨细胞ERβ 蛋白表达 实验分组同“2.3.1”项。细胞接种、药物干预72 h、细胞收集，加入含1% PMSF 的RIPA 裂解液，冰上静置30 min使细胞充分裂解，收集蛋白。100 ℃煮样5 min 使蛋白变性，采用考马斯亮蓝法进行蛋白定量。根据目的蛋白分子质量配制8% SDS-PAGE 凝胶，调整上样量一致进行电泳。常规湿转操作。室温下5% 脱脂牛奶封闭2 h。ERβ 抗体按1 ∶400 稀释，4 ℃孵育过夜，HRP 标记的二抗1 ∶1 000 稀释，室温孵育2 h。暗室中加ECL 显色。曝光、显影、定影，Quantity One 图像分析系统检测各组ERβ 及内参βactin 光密度值，以两者之比代表ERβ 蛋白的相对表达量。

2.4 ICI 182780、E2及ISO 对成骨细胞ERβ mRNA 及蛋白表达的影响

2.4.1 RT-PCR 检测ICI 182780、E2及ISO 干预后成骨细胞ERβ mRNA 表达 实验分为空白对照组，1 000 μg/L 淡豆豉异黄酮组，淡豆豉异黄酮(1 000 μg/L) + ICI 182780 (10 nmol/L)组(ICI 182780 于淡豆豉异黄酮干预前2 h 进行孵育)，1 nmol/L E2组及1 000 μg/L ISO 组。其余方法同“2.3.1”项。

2.4.2 Western blot 检测ICI 182780、E2及ISO 干预后成骨细胞ERβ 蛋白表达 实验分组同“2.4.1”项。方法同“2.3.2”项。

3 结果

3.1 成骨细胞形态观察及鉴定 传代细胞培养3 d后形状基本稳定，呈三角形、纤维束状、条索状(图1 A)。随着培养时间的延长，可见成骨细胞生长融合，呈“铺路石”状。第5 代成骨细胞碱性磷酸酶染色后显微镜下可见细胞胞浆内有紫蓝色颗粒，呈阳性反应，证明培养的细胞为成骨细胞(图1 B)。

图1 大鼠成骨细胞形态学观察及碱性磷酸酶染色鉴定(×200)Fig.1 Typical morphology observation of cultured rat osteoblasts and identification by Alkaline phosphatase staining (× 200)

3.2 淡豆豉异黄酮对成骨细胞增殖的影响 与空白对照组相比，淡豆豉异黄酮在质量浓度为1 μg/L时处理48 h 促进成骨细胞增殖(P ＜0.01)，在质量浓度为10、100、1 000 μg/L 时处理48 及72 h均显著促进成骨细胞增殖(P ＜0.01);1 000 μg/L ISO 干预48 及72 h 促进成骨细胞增殖(P ＜0.01或P ＜0.05);1 nmol/L E2处理48 h 促进成骨细胞增殖(P ＜0.01)。MTT 结果提示，干预48 h 后1 000 μg/L 淡豆豉异黄酮诱导的成骨细胞增殖作用被10 nmol/L ICI 182780 明显拮抗(P ＜0.01)，干预72 h 后1 000 μg/L 淡豆豉异黄酮促增殖作用被ICI 182780 完全拮抗，与空白对照组细胞增殖情况无显著性差异(P ＞0.05)。且干预72 h 后，1 000 μg/L 淡豆豉异黄酮作用优于同剂量ISO 组(P ＜0.05)(表1)。

表1 不同质量浓度淡豆豉异黄酮、E2 及ISO 对大鼠成骨细胞增殖的影响(±s，n=6)Tab.1 Effects of different concentrations of ISSP，E2 and ISO on the proliferation of rat osteoblasts (±s，n=6)

表1 不同质量浓度淡豆豉异黄酮、E2 及ISO 对大鼠成骨细胞增殖的影响(±s，n=6)Tab.1 Effects of different concentrations of ISSP，E2 and ISO on the proliferation of rat osteoblasts (±s，n=6)

注:与空白对照组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与1 000 μg/L ISSP 比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01

组别 OD 值48 h 72 h空白对照组0.203 ±0.012 0.276 ±0.013 1 μg/L 淡豆豉异黄酮 0.263 ±0.014＊＊ 0.295 ±0.015 10 μg/L 淡豆豉异黄酮 0.271 ±0.012＊＊ 0.304 ±0.024＊＊100 μg/L 淡豆豉异黄酮 0.266 ±0.009＊＊ 0.310 ±0.025＊＊1 000 μg/L 淡豆豉异黄酮 0.273 ±0.009＊＊ 0.320 ±0.017＊＊1 000 μg/L 淡豆豉异黄酮+ICI 182780 0.235 ±0.024＊＊## 0.289 ±0.010##1 nmol/L E2 0.250 ±0.026＊＊ 0.290 ±0.021 1 000 μg/L ISO 0.253 ±0.030＊＊ 0.298 ±0.017*#

3.3 不同质量浓度淡豆豉异黄酮对成骨细胞ERβ mRNA 及蛋白表达的影响 与空白对照组比较，淡豆豉异黄酮(1、10、100、1 000 μg/L)可以明显上调ERβ mRNA 的表达水平(P ＜0.01)(图2 A)。与空白对照组比较，淡豆豉异黄酮(1、10、100、1 000 μg/L)可以明显上调ERβ 蛋白表达水平(P ＜0.01)(图2 B)。

图2 不同质量浓度淡豆豉异黄酮对大鼠成骨细胞ERβ mRNA 及蛋白表达的影响(±s，n=3)Fig.2 Effects of different concentrations of ISSP on the expressions of ERβ mRNA and protein in rat osteoblasts (±s，n=3)

3.4 ICI 182780、E2及ISO 对成骨细胞ERβ mRNA及蛋白表达的影响

3.4.1 ICI 182780、E2及ISO 对成骨细胞ERβ mRNA 表达的影响 与空白对照组相比，1 000 μg/L淡豆豉异黄酮组ERβ mRNA 表达升高(P ＜0.05)，1 nmol/L E2组ERβ mRNA 表达升高(P ＜0.01)。10 nmol/L ICI 182780 能够完全拮抗1 000 μg/L 淡豆豉异黄酮上调ERβ mRNA 表达的作用，与空白对照组表达情况无显著差异(P ＞0.05)(图3A)。

3.4.2 ICI 182780、E2及ISO 对成骨细胞ERβ 蛋白表达的影响 与空白对照组相比，1 000 μg/L 淡豆豉异黄酮、1 nmol/L E2及1 000 μg/L ISO 组ERβ蛋白表达水平显著升高(P ＜0.01 或P ＜0.05)。加入拮抗剂后，1 000 μg/L 淡豆豉异黄酮的上述作用被完全拮抗，与空白对照组无显著差异(P ＞0.05)。1 000 μg/L 淡豆豉异黄酮上调ERβ 蛋白表达的作用优于同剂量ISO 组(P ＜0.01)(图3 B)。

图3 ICI 182780、E2 及ISO 对大鼠成骨细胞ERβ mRNA 及蛋白表达的影响(±s，n=3)Fig.3 Effects of ICI 182780，E2 and ISO on the expressions of ERβ mRNA and protein in rat osteoblasts (±s，n=3)

4 讨论

成骨细胞起源于多能间质干细胞(MSCs)，负责合成骨基质及促进随后的矿化，是骨形成的主要功能细胞，成骨细胞的增殖在很大程度上决定了最终形成的骨量。本实验采用原代培养大鼠成骨细胞的方法，观察淡豆豉异黄酮对成骨细胞增殖的影响，结果显示:4 种不同质量浓度(1、10、100、1 000 μg/L)的淡豆豉异黄酮均能显著促进成骨细胞增殖。将雌激素受体拮抗剂ICI 182780 与1 000 μg/L 淡豆豉异黄酮共孵育，发现1 000 μg/L 淡豆豉异黄酮促增殖作用被明显拮抗，药物干预72 h 后其促增殖效果降至空白对照组水平，推测淡豆豉异黄酮是通过雌激素受体介导而产生上述影响的。

雌激素受体属核受体超家族成员，有ERα、ERβ两种亚型。ERs 表达于所有关系到骨形成及骨吸收的细胞成分中，主要定位于生长板软骨细胞和成骨细胞中［5］。雌激素通过激活ERα 和ERβ 对成骨细胞发挥多种生物学效应［6］。研究表明［7-8］多数植物雌激素对ER 具有一定的选择性，往往对ERβ 的亲和力大于ERα。本实验采用RT-PCR 和Western blot 法检测淡豆豉异黄酮干预后成骨细胞ERβ mRNA 及蛋白表达水平的变化，发现不同质量浓度淡豆豉异黄酮均明显上调ERβ mRNA 及ERβ 蛋白表达(P ＜0.01)。与ICI 182780 共孵育时，成骨细胞ERβ mRNA 及蛋白表达被拮抗，相比单独应用1 000 μg/L淡豆豉异黄酮作用于成骨细胞ERβ mRNA 及蛋白表达水平下降，实验结果进一步证实了淡豆豉异黄酮具有雌激素样作用，其促进成骨细胞增殖的效应可能是通过上调成骨细胞ERβ 表达完成的。

淡豆豉含有大豆中的12 种异黄酮类组分，分为游离型苷元和结合型糖苷两类。课题组前期研究发现淡豆豉炮制后其中的主要异黄酮类活性成分大豆苷元和染料木素含有量升高，相应糖苷含有量降低［9］。也有报道表明游离型苷元是大豆异黄酮在体内发挥生物活性的主体［10］。本实验通过体外研究发现干预72 h 后1 000 μg/L 淡豆豉异黄酮促成骨细胞增殖及上调ERβ 蛋白表达的作用略优于同剂量大豆异黄酮组，这可能与炮制后苷向苷元转化有关，具体机制有待进一步研究。

［1］ Riggs B L，Khosla S，Melton L J. A unitary model for involutional osteoporosis:estrogen deficiency causes both typeⅠand typeⅡosteoporosis in postmenopausal women and contributes to bone loss in aging men［J］. J Bone Miner Res，1998，13 (5):763-773.

［2］ 牛丽颖，王鑫国，任艳青，等. 淡豆豉提取物对去卵巢骨质疏松大鼠骨微细结构的改善作用［J］. 中成药，2010，32(11):1874-1876.

［3］ 李 双，牛丽颖，窦玉红，等. 淡豆豉对去卵巢骨质疏松大鼠骨生物力学性能的影响［J］. 中药药理与临床，2008，24(2):57-58.

［4］ 王建华，张军芳，吕 萍，等. 异补骨脂素加锌对大鼠成骨细胞相关细胞因子表达影响的实验研究［J］. 天然产物研究与开发，2010，22(3):403-407.

［5］ Lanyon L，Armstrong V，Ong D，et al. Is estrogen receptor alpha key to controlling bones’resistance to fracture?［J］. J Endocrinol，2004，182(2):183-191.

［6］ 王 凌，李大金. 雌激素受体亚型对成骨细胞的调控作用［J］. 中华老年医学杂志，2005，24(9):715-717.

［7］ Gutendorf B，Westendorf J. Comparison of an array of in vitro assays for the assessment of the estrogenic potential of natural and synthetic estrogens，phytoestrogens and xenoestrogens［J］. Toxicology，2001，166(1-2):79-89.

［8］ Cvoro A，Paruthiyil S，Jones J O，et al. Selective activation of estrogen receptor-beta transcriptional pathways by a herbal extract［J］. Endocrinology，2007，148(2):538-547.

［9］ 牛丽颖，杜红娜，刘 姣，等. 淡豆豉炮制前后异黄酮组分含量的比较研究［J］. 大豆科学，2008，27(4):672-674.

［10］ 韩 婷，程 钢，刘 莹，等. β-葡萄糖苷酶以及益生菌生物转化大豆异黄酮糖苷的研究进展［J］. 食品科学，2010，31(9):333-337.