丹蛭降糖胶囊对糖尿病大鼠腹主动脉超微结构、MCP-1、抵抗素mRNA 表达的影响

鲍陶陶， 杨晓春， 储全根

(1. 安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥230031;2. 安徽中医药大学，安徽 合肥230038)

血管病变是2 型糖尿病最为常见及严重的慢性并发症之一，是导致糖尿病患者致残、死亡的主要原因。高糖、炎症因子、活性氧、高胆固醇、糖基化终产物增多及氧化应激等造成血管内皮功能障碍是血管病变主要因素［1］，近年来已成为研究热点并取得一定成就。由于大血管病变是导致糖尿病患者死亡率增加的主要原因［2-3］，占糖尿病死亡原因的65%～75%［4］，为进一步了解2 型糖尿病大血管病变主要情况及中医中药对其作用，本实验采用透射电子显微镜观察丹蛭降糖胶囊对糖尿病大鼠腹主动脉超微结构及MCP-1、血管内皮细胞抵抗素mRNA 表达水平的影响。

1 材料

1.1 动物 6 ～8 周龄SD 雄性大鼠104 只，体质量(200±20)g，SCXK (苏)2011-0003，由常州卡文斯实验有限公司提供。购入后每笼6 ～7 只喂养，动物自由觅食饮水，在室温25 ℃、相对湿度(50 ±5)%环境下喂养1 周，适应环境后开始实验。

1.2 药物 丹蛭降糖胶囊(安徽中医药大学第一附属医院院内制剂，已获得国家发明专利，专利号ZL200310112845.1，由安徽中医药大学第一附属医院药物制剂中心提供，0.35g/粒);西药选用盐酸吡格列酮胶囊，15 mg/粒(杭州中美华东制药有限公司)。

1.3 试剂与仪器 稳豪倍优血糖仪购自南京医药合肥大药房;链尿佐菌素STZ (S0130)购自Sigma 公司;电镜为日本电子公司产品，型号JEM-1230;荧光定量PCR 仪 (PIKOREAL 96)购自Thermo 公司;引物合成购自Invitrogen 公司;逆转录试剂盒(RevertAid TM first Strand cDNA Synthesis Kit)购自Thermo 公司;DL2000 DNA Marker 购自TaKaRa;TRIzol 购自Invitrogen 公司;SYBR Green染料购自Qiagen 公司。

2 方法

2.1 造模分组与给药 将104 只大鼠随机分成7组，即正常组，模型组，中药高、中、低剂量组，西药组，中西药结合组。各组间体质量无显著性差异，明暗周期12/12 h，自由摄食、饮水，正常组继续喂以基础饲料至实验结束。模型组及治疗组喂以高糖高脂饲料(在68.5%基础标准饲料中添加10%的猪油、20%的蔗糖、1%的胆固醇、0.5%的胆酸钠加工制作)，共计4 周。然后按30 mg/kg 体质量的剂量腹腔内注射STZ，5 d 后检测血糖指标，不达标者再按25 mg/kg 体质量的剂量腹腔内注射STZ。造模成功的标准为于最后一次注射5 d 后测定尾静脉随机血糖，大于16.7 mmol/L 者为2 型糖尿病(T2DM)造模成功。选择符合诊断标准的模型大鼠77 只再重新随机分为6 组，模型组12 只，其余每组13 只，模型组和治疗组均继续喂以高糖高脂饲料至实验结束。给药方法为中药高、中、低组大鼠每日分别给予丹蛭降糖胶囊1.08、0.72、0.54 g/(kg·d)灌胃(分别为成人kg 体质量折算剂量的12、8、6 倍)。盐酸吡格列酮胶囊量参照文献给予10 mg/(kg·d)。模型组与正常组予生理盐水5 mL/(kg·d)灌胃，中西药结合组每日予丹蛭降糖胶囊1.08 g/(kg ·d)混合吡格列酮10 mg/(kg·d)灌胃，给药时间为8 周。实验过程中各组大鼠均有2 ～4 只死亡，其中6 只死于殴打，余未明原因死亡，可能与并发症相关(未进行进一步检测)。末次给药后大鼠禁食12 h，所有大鼠麻醉处死后剪取腹主动脉进行相关检测(出于经费、经济效益考虑，随检测项目随机原则抽取适量动物检测)。

2.2 检测指标与方法

2.2.1 腹主动脉电镜观察 各组随机取大鼠3 只，麻醉处死后，于大鼠膈膜下及左右髂总动脉的分叉处剪取腹主动脉并切成1 mm3小块，用体积分数为2.5%的戊二醛固定12 h，再固定于1% 锇酸2 h，酒精梯度脱水，环氧丙烷透明，Epon812 环氧树脂包埋，LKB4 型超薄机切片，片厚70 nm。电子染色(用醋酸铀饱和液和枸橼酸铅染液双染色)，最后置于透射电镜下观察切片并拍照。

2.2.2 荧光定量逆转录-多聚酶链反应 (RTqPCR) 采用RT-qPCR 方法测定MCP-1、血管内皮细胞抵抗素在血管内皮中的mRNA 表达。称取组织50 ～100 mg，加入1 mL TRIzol 匀浆裂解、离心进行RNA 提取，然后加入20 ～50 μL DEPC 水，分别测定OD260 和OD280 值计算纯度及浓度，A260/A280值均在1.8 ～2.0 之间。再加入5 × Reaction Buffer 4.0 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2 μL、RibolockTM Rnase inhibitor 1 μL、RevertAidTM MMuLV Reverse Transcniptase 1 μL。42 ℃60 min，70 ℃5 min 反转录，取出上述反应液，即为cDNA，-80 ℃保存备用。循环条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火和延伸30 s，共40个循环。每一次RT-qPCR 反应至少重复3 次。实验所使用的分析方法为relative quantification study，计算方法为2-ΔΔct。荧光定量引物序列见表1。

表1 荧光定量引物序列Tab.1 Sequences of the primers used in RT-qPCR

2.3 统计学方法 采用SPSS 17.0 软件进行统计学处理，数据用±s 表示，采用方差分析法，以P ＜0.05 为差异具有统计学意义，两组间显著性差异采用LSD-t 检验。

3 结果

3.1 腹主动脉超微结构

3.1.1 正常组 内膜由内皮层、内皮下层和内弹性膜构成。内皮下层位于内皮之外，为较薄的疏松结缔组织，内含少量平滑肌纤维;内弹性膜由弹性蛋白构成，弹性膜上有许多小孔，各层结构较为完整，内皮无增生及脱落，固有膜血管未见明显充血扩张，少许泡沫细胞形成。内膜表面较平滑，内皮细胞多扁平，结构清晰，核染色分布均匀，核膜未见扩张，线粒体基本完好，粗面内质网基本正常，弹力膜较均质，见图1A、1B。

3.1.2 模型组 内膜较正常组明显增厚且粗糙不平，内弹性膜不连贯;线粒体明显增多、肿胀，线粒体嵴基本消失，呈空泡变性;细胞核与细胞质之间出现空隙，核膜消失，内皮下细胞浸润、肿胀和脂质沉积，腔内大量泡沫细胞及纤维组织，泡沫细胞及增生纤维组织，粗面内质网扩张，断裂及减少，弹力膜不均质有损伤，见图1C、1D。

3.1.3 治疗组 整体相对模型组病变有所改善，其中，中药高剂量组接近正常组，其他组疗效依次为西药组、中药中剂量、中西药结合组、中药低剂量组。

3.1.3.1 西药组 少数线粒体肿胀，空泡变，部分粗面内质网轻度扩张，弹力膜较均质，见图1E。

3.1.3.2 中西药结合组 部分粒体扩张及空泡变，粗面内质网有断裂，部分弹力膜有损伤，见图1F。

3.1.3.3 丹蛭降糖胶囊高剂量组 少数线粒体轻微肿胀，空泡化，少数粗面内质网减少，弹力膜较均质，见图1G。

3.1.3.4 丹蛭降糖胶囊中剂量组 部分线粒体破坏有空泡变，粗面内质网减少，弹力膜有少数损伤，见图1H。

3.1.3.5 丹蛭降糖胶囊低剂量组 线粒体扩张及空泡变，粗面内质网断裂，弹力膜损伤，见图1I。

3.2 各组大鼠MCP-1、血管内皮细胞抵抗素的mRNA 表达的情况 经药物治疗后，MCP-1、血管内皮细胞抵抗素mRNA 表达水平均有下调，与模型组比较，其差异有统计学意义(P ＜0.01)。其中，中药高、中剂量组和西药组间MCP-1、抵抗素无统计学意义，中药高剂量组与低剂量组、中西药结合组MCP-1 差异有统计学意义(P ＜0.05，表2)。该结果说明丹蛭降糖胶囊及吡格列酮均能抑制糖尿病大鼠血管MCP-1、抵抗素mRNA 表达水平，其中中药高剂量组及西药组效果最好。

表2 各组大鼠腹主动脉MCP-1、抵抗素mRNA 测定结果比较(±s，n=6)Tab.2 Comparison of result of rat abdominal aortic MCP-1 and resistin mRNA in each group (±s，n=6)

表2 各组大鼠腹主动脉MCP-1、抵抗素mRNA 测定结果比较(±s，n=6)Tab.2 Comparison of result of rat abdominal aortic MCP-1 and resistin mRNA in each group (±s，n=6)

注:与正常组比较，* P ＜0.01;与模型组比较，△P ＜0.01;与模型组比较，▲P ＜0.05;与中药高剂量组比较，▼P ＜0.05

组别 MCP-1 抵抗素mRNA正常组1.00 ±0.08 1.01 ±0.13模型组 2.50 ±0.21* 2.71 ±0.62*丹蛭降糖胶囊高剂量组 1.45 ±0.06△ 1.70 ±0.13△丹蛭降糖胶囊中剂量组 1.53 ±0.07△ 1.57 ±0.12△丹蛭降糖胶囊低剂量组 2.24 ±0.19▼ 2.42 ±0.46西药组 1.40 ±0.16△ 1.67 ±0.13△中西药结合组 2.02 ±0.20△▼ 2.14 ±0.22▲

图1 各组大鼠腹主动脉超微结构Fig.1 Rat abdominal aortic ultrastructures in each group

4 讨论

益气活血法是中医治疗血管病变的重要治则之一。中药复方制剂丹蛭降糖胶囊具有益气活血功效，由太子参、丹皮、水蛭、泽泻、生地黄、菟丝子等组成，全方寒温并调，补通兼施，共凑益气活血养阴通络之效。以往研究发现其能改善糖尿病的IR，改善糖代谢，抑制血管内皮损伤，保护氧化应激损伤组织，干预糖尿病血管病变的血栓前状态［5-7］。选取作为对照的吡格列酮胶囊为临床所常用的胰岛素增敏剂，研究发现其具有较好降糖作用，可改善胰岛素抵抗提高胰岛素对细胞的反应性，较好改善血管内皮功能［8-9］。抵抗素是脂肪细胞和单核能源性细胞因子，不仅参与胰岛素抵抗的发生，而且是重要的血管活性物质之一，可直接或间接影响血管内皮细胞功能［10-11］。MCP-1 是重要炎症因子，通过与单核细胞表面受体-2 结合，使血液中的单核细胞迁入血管内膜下，促使血管壁的单核细胞吞噬大量的修饰脂蛋白形成泡沫细胞，促进血管平滑肌细胞的增殖和移动，刺激炎症产生，与内皮细胞功能障碍密切关系［12-13］。

实验结果中，模型组大鼠腹主动脉内膜明显增厚，内皮下脂质沉积，有大量泡沫细胞形成，管腔变窄，表明糖尿病血管病变模型成功。经药物治疗8 周后，主动脉电镜显示益气活血方和吡格列酮组内膜表面突起、增厚，内弹性膜不连贯，线粒体增多、肿胀，粗面内质网扩张，断裂及减少等超微结构均较模型组有所改善，均能减轻糖尿病大鼠腹主动脉形态学损害，其中中药高剂量组改善最为明显，这与前期试验研究丹蛭降糖胶囊能改善血管内皮功能结果［3-4］相类似。此外益气活血方和吡格列酮组均能显著抑制抵抗素及MCP-1 mRNA 水平。本研究电镜观察发现2 型糖尿病模型大鼠主动脉内皮细胞的线粒体肿胀、功能障碍，可能与高血糖引起细胞能量代谢障碍，MCP-1，抵抗素有密切关系［14-17］，电镜观察主动脉超微结构变化与MCP-1，抵抗素mRNA 表达情况相对应，亦提示MCP-1，抵抗素与T2DM 血管病变有重要关系，可为治疗2型糖尿病血管病变的重要靶点。而研究中中西药结合组在主动脉超微结构与抵抗素及MCP-1 mRNA水平不理想，均较单独中药组或西药组稍差，推测原因:①由于实验过程中的误差导致错误结果;②排除实验误差因素，此结果可能由于中、西药剂量比例分配导致，其确切原因有待探索。

综合实验结果表明，运用益气活血方可能改善和延缓糖尿病血管病变的进展，可为运用中医中药防治2 型糖尿病各类血管并发症提供理论依据及思路，同时也提示可能为其他心脑血管疾病和周围血管疾病的防治有效途径。

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