土茯苓叶提取物镇痛抗炎作用的实验研究①

韦贤，王金妮，潘勇，黄祖良

（右江民族医学院，广西 百色 533000 E-mail：wei700＠126.com）

土茯苓为百合科光叶菝葜［Smilax glabra Roxb］植物的干燥根茎，亦称赤土茯苓［1］，味甘、淡、平，归肝、胃经，具有除湿、解毒、通利关节之功效。国内外学者对土茯苓有较为广博的研究，早期研究显示土茯苓含有的甾体皂甙元可作为我国制作口服避孕药的主要半合成原料，含有鞣质可作栲胶，淀粉可酿酒和制做糕点［2-3］。在临床应用进展上主要用于治疗湿热淋浊、痛肿、瘰疬、疥癣、梅毒及汞中毒所致肢体拘挛、筋骨疼痛等症［4］。近年来，不但有土茯苓的单方制剂的活性试验研究报道，而且也有含土茯苓成分的复方制剂的药理活性试验研究，目前报道含中药土茯苓的主要研究对象是其根和茎，且集中于多糖、黄酮、三萜类等化学成分的研究报道，药理活性试验表明，土茯苓在抗炎、镇痛、利尿、抗癌、抗动脉硬化和治疗冠心病、心绞痛等方面效果良好［5-6］。而对土茯苓叶的化学成分及药理研究很少。依据已有文献报道的活性试验，我们对土茯苓叶提取物开展镇痛抗炎作用实验研究，希望为进一步开发当地土茯苓叶的应用提供一些理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 药材 土茯苓叶，采于百色城东市郊。经鉴定为光叶菝葜，室温下晾干，备用。硫酸四氢帕马丁注射液（罗通定）：湖南中南科伦药业有限公司。醋酸地塞米松片；天津力生制药股份有限公司，研磨后以1% 的阿拉伯胶溶液配成混悬液，备用。

1.1.2 实验动物 昆明小鼠，体重（18±2）g；Wistar大鼠，体重（180±20）g。SPF 级，均为右江民族医学院实验动物中心提供［使用许可证：syxk（桂）2011-0010，生产许可证号：syxk（桂）2012-0003］。

1.1.3 主要仪器 电子分析天平（AL104），梅特勒-托利多；电热恒温水浴箱（HH600），上海比朗仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 土茯苓叶提取物制备 晾干的土茯苓叶粉粹后用水提取（煮沸0.5h，提取3次，过滤，合并滤液），减压浓缩至膏状后用乙醇萃取，回收乙醇（每克提取物相当于100g生药），用时再配成相应的浓度。

1.2.2 镇痛实验［7-10］

1.2.2.1 对小鼠热板镇痛实验 将热板仪调至55℃，选取基础痛阈在5～30s之间的雌性小鼠50只，随机分成5组，即：空白对照（NS）组，土茯苓叶提取物高、中、低（0.5、1.0、2.0g·kg-1）3 个剂量组和阳性对照（罗通定0.06g·kg-1）组，每组10只。测各鼠3次痛阈，取平均值作为基础痛阈。分别给予灌胃土茯苓叶提取物、NS，阳性对照组腹腔注射罗通定1次，给药后30、60、90、120、150、180min分别检测各鼠的痛阈，比较各组给药后不同时间痛阈值与基础痛阈值的差值。

1.2.2.2 小鼠扭体法镇痛实验 选取雌性小鼠40只，随机分成5组，灌胃土茯苓叶提取物、NS，阳性对照组腹腔注射罗通定1次，给药后1h分别腹腔注射0.6%的醋酸溶液0.2 毫升／只致痛，并立即观察记录注射醋酸溶液后15min内各组发生扭体反应的鼠数及扭体次数。

1.2.3 抗炎实验［10-14］

1.2.3.1 对小鼠耳廓二甲苯致炎的抗炎实验 选用NIH 小鼠40 只，雄性，体重（20±2）g。随机分成5组，分别为空白对照组（NS），土茯苓叶提取物高、中、低（0.5、1.0、2.0g·kg-1）3个剂量组和地塞米松组（0.05g·kg-1），灌胃土茯苓叶提取物、NS、地塞米松，每天1次，连续3d，最后一次给药1h后，各鼠左耳前后两面涂100%二甲苯致炎液0.05 毫升／只（室温26 ℃）。1h后处死小鼠，剪下左右两耳，用直径8 mm 打孔器在同一部位冲下耳片，电子天平称重，以左右耳片重量差值表示肿胀度。

1.2.3.2 对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀的影响 选用Wistar大鼠40只，雄性，体重（180±20）g。随机分为5组，分别为空白对照组（NS）、土茯苓叶提取物高、中、低3个剂量组、地塞米松组（0.05g·kg-1）。用蓝墨水在各鼠右后肢踝关节周围做记号，并测定标记线以下的排水量做药前足趾的容积。灌胃给药或NS，1 h后每只大鼠右后足跖皮下注射1%角叉菜胶0.1ml（室温24 ℃），于注射后30、60、120、180、240min分别测定各鼠右后足趾容积1次，比较各组药后不同时间右后足趾容积与药前容积的差值。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，计量资料采用（±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK 法，以P ＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 土茯苓叶提取物对小鼠热板镇痛实验的影响 结果见表1。土茯苓叶提取物可以延长小鼠热板痛响应时间，其中0.5g·kg-1组给药后120～150 min、1.0g·kg-1组给药后90～180min以及2.0g·kg-1组给药后60～180 min内作用较为明显，而与NS 组比较差异有统计学意义。但与罗通定组比较，土茯苓叶提取物的镇痛效果比较弱且起效慢。

表1 土茯苓叶提取物对小鼠热板痛阈差值的影响 （±s，秒，n＝10）

表1 土茯苓叶提取物对小鼠热板痛阈差值的影响 （±s，秒，n＝10）

注：与NS组比较，a：P ＜0.05，b：P ＜0.01

组别 剂量（g／kg-1）30min 60min 90min 120min 150min 180min NS组-2.2±3.1 2.3±5.2 2.0±4.7 1.8±3.7 2.0±3.4 1.5±4.7土茯苓叶提取物0.5 2.9±5.8 3.1±5.1 4.6±4.8 7.1±7.3 7.4±4.7 6.2±5.0 1.0 3.2±4.7 3.7±4.9 7.9±3.9a9.0±6.8b 11.0±7.8b 8.5±5.6b 2.0 4.2±4.6 8.5±5.2a11.1±5.3b 14.7±9.4b 15.1±7.9b 13.4±7.6b罗通定组0.06 11.6±7.9b 16.6±6.6b 18.6±9.5b 15.4±8.9b 14.1±9.7b 13.9±.1 b

2.2 土茯苓提取物叶对醋酸所致小鼠扭体反应的影响 结果见表2。3个不同剂量组的土茯苓叶提取物均能显著减少醋酸所致的小鼠扭体次数，与NS组相比较差异有统计学意义，且镇痛率与剂量相关。2.0g·kg-1组和罗通定组均可减少扭体鼠数，但罗通定组对扭体反应的抑制率更高。

2.3 土茯苓叶提取物对二甲苯致小鼠耳壳肿胀的影响 结果见表3。实验表明，0.5g·kg-1组对二甲苯所致的鼠耳肿胀几乎无抑制作用，与NS 组比较差异无统计学意义（P ＞0.05）。1.0、2.0g·kg-1组对鼠耳肿胀的抑制作用非常显著。其中，地塞米松组作用最强，土茯苓叶提取物各组呈明显的量效关系。显示土茯苓叶提取物抗炎作用需大剂量才显效。

表2 土茯苓叶提取物对小鼠扭体反应的影响（±s，n＝8）

表2 土茯苓叶提取物对小鼠扭体反应的影响（±s，n＝8）

注：与NS组比较，a：P ＜0.05，b：P ＜0.01

组别 剂量（g·kg-1）扭体鼠数扭体次数抑制率（%）NS组-10 51.9±16.8-土茯苓叶提取物0.5 8 36.5±16.9a29.7 1.0 7 25.6±11.5b 50.7 2.0 7 20.5±14.4b 60.5罗通定组0.06 5 19.8±16.1b 61.8

表3 土茯苓叶提取物对二甲苯致小鼠耳壳肿胀的影响 （±s，n＝8）

表3 土茯苓叶提取物对二甲苯致小鼠耳壳肿胀的影响 （±s，n＝8）

注：与NS组比较，a：P ＜0.05，b：P ＜0.01

组别 剂量（g·kg-1）肿胀度（mg／10g）肿胀抑制率（%）NS组-2.79±1.01-土茯苓叶提取物0.5 1.98±0.85a29.0 1.0 1.51±0.81b 45.9 2.0 1.29±0.79b 53.8地塞米松组0.005 1.26±0.67b 54.8

2.4 土茯苓叶提取物对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀的影响 结果见表4。结果表明，0.5g·kg-1组作用弱（P ＞0.05），1.0、2.0g·kg-1组对角叉菜胶引起大鼠足趾肿胀均有显著的抑制作用，和NS 组比较差异有统计学意义（P ＜0.05或P ＜0.01）。2.0g·kg-1组作用与地塞米松组相近。

表4 土茯苓叶提取物对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀度的影响 （±s，ml，n＝8）

表4 土茯苓叶提取物对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀度的影响 （±s，ml，n＝8）

注：与NS组比较，a：P ＜0.05，b：P ＜0.01

组别 剂量（g·kg-1）30min 60min 120min 180min 240min NS组-0.400±0.07 0.61±0.11 0.79±0.11 0.65±0.11 0.50±0.09土茯苓叶提取物0.5 0.37±0.10 0.55±0.15 0.68±0.19 0.59±0.12 0.44±0.08 1.0 0.32±0.08a0.44±0.09b 0.57±0.12b 0.49±0.15a0.35±0.11b 2.0 0.28±0.07b 0.39±0.10b 0.52±0.11b 0.45±0.07b 0.35±0.11b地塞米松组0.005 0.26±0.10b 0.40±0.16b 0.51±0.09b 0.43±0.08b 0.34±0.11 b

3 讨论

土茯苓，主治清热除湿解毒，因其价格低廉，应用广泛，在我国中医药方面有着悠久的应用历史，现行的2010版中国药典也有记载。近年来，对土茯苓生药学研究比较深入，主要是研究土茯苓根茎的化学成分及其药理作用，陈秀芬等［15］及张自嘉等［16］报道了土茯苓水、醇提物对二甲苯所致小鼠耳肿胀、角叉菜胶所致的小鼠足肿胀及对醋酸所致小鼠扭体反应均有明显抑制作用，但对土茯苓叶的化学成分及药理作用研究极少，对其资源学方面的研究也较少，本实验通过采用经典的化学因素所导致的渗出性炎症实验模型来开展药效学研究，具有高度的重复性和可靠性。实验数据表明土茯苓叶提取物能延长小鼠热板刺激体表法致痛的反应时间；能够抑制醋酸刺激腹腔黏膜引起的痛反应，减少小鼠扭体个数及扭体次数。因而得出土茯苓叶提取物对实验动物模型确有明显的镇痛抗炎作用，且呈良好的量效关系；在抗炎实验方面表明，土茯苓叶提取物对二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀、角叉菜胶引起的大鼠足趾肿胀均有显著的抑制作用，在0.5g·kg-1实验组抗炎作用不明显（P ＞0.05），在2.0g·kg-1可有效地预防减轻炎症早期的渗出、水肿症状，可提示土茯苓叶提取物需较大剂量才具有抗炎作用。实验表明了广西产土茯苓叶在抗慢性炎症中具有良好的效果，也可为下一步开发具有高效低毒作用的抗炎药物奠定基础。

在炎症反应中，存在多样性和复杂性，起主要作用的细胞因子是TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β、IL-8、IL-l0等，而本实验仅对土茯苓叶提取物的镇痛抗炎作用进行初步研究，至于其何种成分通过何种途径发挥抗炎作用，其详实的机制尚待进一步的研究。为了更好地开发土茯苓叶及其制剂，下一步将对土茯苓叶药用有效部位分离及作用机制进行深入研究，为充分合理利用当地丰富的土茯苓资源提供理论依据。

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