PL-11血小板分析仪检测血小板计数及聚集功能的性能评价

蔡玉婵，赵旭鸿，韩平，陈昌明，李智

(同济大学附属杨浦医院检验科，上海200090)

PL-11血小板分析仪检测血小板计数及聚集功能的性能评价

蔡玉婵，赵旭鸿，韩平，陈昌明，李智

(同济大学附属杨浦医院检验科，上海200090)

目的探讨PL-11血小板分析仪在检测血小板数量及聚集功能方面的性能。方法按照美国临床实验室标准化协会(CLSI)制定的仪器性能验证标准及我国卫生行业标准WS/T 406-2012《临床血液学检验常规项目分析质量要求》对PL-11血小板分析仪进行血小板计数及聚集功能的性能评价。采用PL-11血小板分析仪、LBY-NJ4血小板聚集仪及TEG-5000血栓弹力图仪检测健康人群血小板聚集率，分析各仪器检测结果间的相关性。结果PL-11血小板分析仪的批内及日间精密度均＜1/3总误差(7%);携带污染率为0.32%;在(4.12～1 380.4)×109/L线性范围内回归方程斜率为1.03，R2=0.993;血小板计数结果与血小板参考方法的结果符合率为84%，均符合行业标准要求。分别采用PL-11血小板分析仪、LBY-NJ4血小板聚集仪及TEG-5000血栓弹力图仪检测79例2型糖尿病患者单服用氯匹格雷前、后血小板聚集率，3种仪器之间差异均无统计学意义(P＞0.05)，患者服药前、后血小板聚集率差异有统计学意义(P＜0.01)。结论PL-11血小板分析仪可为临床提供准确、可靠的血小板计数及聚集功能的检测结果。

血小板聚集;血小板分析仪;连续血小板计数;性能评价

血栓病在人口老年化和多发病谱改变下越来越得到临床重视。随着抗血小板药物的广泛使用，如何科学的进行个体化治疗和疗效评价成为一个热门话题。血栓形成的关键和首要因素是血小板［1］，其聚集功能是血小板的一项重要功能，在血栓形成、动脉粥样硬化中起重要作用，也是目前临床实践中对血小板功能活化程度判断的金标准。但目前血小板聚集功能尚无金标准检测方法。PL-11血小板分析仪采用全血连续检测法对血小板计数并检测血小板聚集功能，这一检测原理被认为是最有希望普及应用的新方法。为此，我们对该仪器在血小板计数和聚集功能方面的性能进行了评估。

材料和方法

一、研究对象

选取2014年1至11月同济大学附属杨浦医院79例2型糖尿病患者，所有病例均符合1997年美国糖尿病学会(American Diabetes Association，ADA)糖尿病诊断标准，其中服用阿司匹林者40例，男23例，女17例，年龄40～80岁;服用氯匹格雷者39例，男21例，女18例，年龄40～78岁。所有患者均排除可能导致凝血功能异常或影响氯匹格雷代谢的疾病，入院前均未服用过抗血小板聚集类药物，入院后单服用阿司匹林100 mg/d［对应的诱聚剂为花生四烯酸(arachidonic acid，AA)］或单服用氯匹格雷75 mg/d［对应的诱聚剂为二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)］，分别在入院时及服药后10 d检测血小板聚集率。血小板计数用的高、低值血小板样本采集自志愿者，共9名，男5名，女4名，年龄55～80岁，均来自同济大学附属杨浦医院血液科。

二、主要仪器和试剂

PL-11血小板分析仪(南京神州英诺华医疗科技有限公司)及配套专用清洗液、血小板稀释液、质控品。EPICS XL型流式细胞仪(美国Beckman-Coulter公司)及配套试剂。Z2颗粒计数仪(美国Beckman-Coulter公司)。LBY-NJ4血小板聚集仪(北京普利生仪器有限公司)及配套试剂。TEG-5000血栓弹力图仪(美国Haemoscope公司)。10～100 μL及100～1 000 μL微量移液器为芬兰LabsyStems公司产品。乙二胺四乙酸二钾(ethylene diamine tetraacetic acid-K2，EDTA-K2)抗凝真空采血管和柠檬酸钠抗凝真空采血管为山东威海医疗器械公司产品。PLR-06血小板诱聚剂ADP及PLR-07血小板诱聚剂AA为南京神州英诺华医疗科技有限公司产品。

三、主要性能评估方法

PL-TI血小板分析仪性能评估方法按美国临床实验室标准化协会(the Clinical and Laboratory Standard Institute，CLSI)制定仪器性能验证标准及我国卫生行业标准WS/T 406-2012《临床血液学检验常规项目分析质量要求》进行。

1.批内精密度按CLSI EP5-A文件［2］要求，取EDTA-K2静脉抗凝血样本，高、中、低值各1份，重复检测20次，分别得出血小板计数的变异系数(CV)。

2.日间精密度取高、中、低定值全血质控物值各1份，每天重复测定2次，取均值()，共测定20 d，得出血小板计数的CV。

3.携带污染率按照CLSI EP10-A文件［3］要求，取EDTA-K2静脉抗凝血，高值和低值样本各1份。高值标本先连续重复测定3次，得到H1、H2、H3;随后测定低值标本，得L1、L2、L3。携带污染率(%)=(L1-L3)/(H3-L3)×100%，其中L1、L3及H3、L3两者相减所得的差取其绝对值。

4.线性范围根据EP6-A文件［4］，将一高值EDTA-K2静脉抗凝血用血细胞分析稀释液稀释至不同浓度水平(100%、80%、60%、40%、20%、10%、5%)，计算线性回归方程及相关系数(R2)。

5.血小板计数准确性选用20份EDTA-K2静脉抗凝血样本，以血小板参考方法(流式细胞术)计数血小板的值为定值，然后在PL-11血小板分析仪上进行单次检测，计算每份样本检测结果与定值的相对偏差，以总误差为评价指标，用相对偏差表示。相对偏差符合PLT≤20%的比例应≥80%。

四、血小板参考方法

按中华人民共和国卫生行业标准WS/T 244-2005《血小板计数参考方法》，将EDTA-K2抗凝血标本用无菌缓冲液进行预稀释，再用特定的荧光抗体(CD41和CD61)对血小板进行染色。用流式细胞术检测血小板和红细胞，根据荧光强度和散射光强度将阈值设在可从红细胞中区分血小板的位置，以检测出红细胞和血小板的比值。用红细胞的计数值除以红细胞/血小板的比值计算出血小板计数值。

五、红细胞计数参考方法

按中华人民共和国卫生行业标准WS/T 245-2005《红细胞和白细胞计数的参考方法》，用单通道阻抗原理的半自动细胞计数仪(Z2颗粒计数仪)计数红细胞。将EDTA-K2抗凝血标本用仪器专用稀释液预稀释4 000倍，以Z2颗粒计数仪进行计数并得到红细胞计数。

六、PL-11血小板分析仪检测血小板聚集率

取500 μL枸橼酸钠抗凝血样本置于仪器待测位，仪器对全血中血小板原始数量检测后，加入诱聚剂(终浓度为4 mmol/L)后继续对血小板数量进行连续计数检测，通过对比未加诱聚剂前血液中血小板数量与加入诱聚剂后血小板数量的变化及血小板下降的速度，评价血小板聚集率。血小板最大聚集率(max aggregation ratio，MAR) (%)=(原始血小板数-聚集后血小板数)/原始血小板数×100;聚集的血小板数量=(原始血小板数-聚集后血小板数)。

七、LBY-NJ4血小板聚集仪检测血小板聚集率

取枸橼酸钠抗凝静脉血标本2 mL，先经800×g离心1 min得到富血小板血浆(platelet rich plasma，PRP)，取出500 μL加至比色杯，再次1 500×g离心10 min得到乏血小板血浆(platelet poor plasma，PPP)，取500 μL加至比色杯，采用LBY-NJ4血小板聚集仪检测。以PPP为空白对照，加诱聚剂(1 mmol/L ADP)5 μL至PRP中(ADP终浓度为10 μmol/L)，其透光度改变最大时得到MAR。

八、TEG检测血小板聚集率

取枸橼酸钠抗凝静脉血标本3 mL，用PL-11血小板分析仪和TEG分别测定AA和ADP诱导的血小板聚集率。

九.统计学方法

结果

一、批内与日间精密度

PL-11血小板分析仪计数血小板的精密度较高(CV＜7%)，测得结果满足WS/T 406-2012中规定的1/3总误差(CV＜7%)。见表1。

表1 PL-11血小板分析仪计数血小板的批内及日间精密度结果

二、携带污染率

按WS/T 406-2012中规定，检测携带污染率时应满足血小板高值＞900×109/L，低值＜30× 109/L。PL-11血小板分析仪计数血小板的携带污染率实际测定值为0.32%，远远低于WS/T 406-2012中规定的4%。见表2。

三、线性范围

按WS/T 406-2012规定，线性回归方程斜率应在1.00±0.05范围内，R2≥0.95。血小板的线性范围为(4.12～1 380.4)×109/L时，回归方程为Y=1.031 8X+9.565 8，R2=0.993，符合要求。见图1。

表2 PL-11血小板分析仪计数血小板的携带污染率结果

图1 线性范围

四、血小板计数的准确性

按WS/T 406-2012规定，血小板计数相对偏差≤20%的比例应≥80%。PL-11血小板分析仪计数血小板值与参考方法相比，相对偏差≤20%的比例为≥84%，符合规定要求。见表3。

五、血小板聚集率检测

对未服用过抗血小板聚集类药物的2型糖尿病患者给予单独氯匹格雷治疗后，分别用PL-11血小板分析仪、LBY-NJ4血小板聚集仪(光比浊法)及TEG-5000血栓弹力图仪检测用药前、后的血小板聚集率。结果显示3种仪器之间差异均无统计学意义(P＞0.05)，但患者用药前、后血小板聚集率差异均有统计学意义(P＜0.01)。见表4。

表3 PL-11血小板分析仪计数血小板的准确性

表4 3种仪器检测2型糖尿病患者单服氯匹格雷前、后的血小板聚集率(%)

讨论

血液内的血小板及凝血因子的共同作用可导致血栓的形成。常规凝血因子的检测已广泛应用于临床，血细胞分析只能检测血小板数量而不能评价血小板功能。目前，对血小板功能的检测方法尚不成熟。血栓病危害预防不当的原因之一是临床无法对高危人群及患者的血小板功能进行合理评价，对抗血小板药物治疗疗效也无法得到合理评价。测定血小板功能，尤其是聚集功能，对血栓性疾病的发病机制、临床诊断和辅助诊断、抗血栓治疗方案的选择、监测抗血小板药物浓度及疗效等研究均具有重要意义［5-6］。因此，建立并完善一种操作简便、准确、快捷的血小板功能评价的新方法仍是研究的热点之一。

PL-11血小板分析仪采用基于库尔特原理的连续自动技术，以“全血连续计数法”原理来动态监测血小板数量变化。该仪器对血小板聚集率的检测是基于血小板计数检测的基础上得出的，所以血小板计数的精密度和准确性对该仪器来说是十分重要的指标。本研究对PL-11血小板分析仪的精密度、携带污染率及线性范围均进行了评估，结果完全符合WS/T 406-2012的规定。精密度评估实验表明PL-11血小板分析仪测定血小板的批内精密度良好，除低值血小板CV＜7%外，其余CV均＜5%。日间精密度显示连续开机20 d性能稳定，除低值血小板CV＜6%外，其余CV均＜5%。携带污染率低仅为0.32%，远低于规定要求。血小板浓度在(4.12～1 380.4)×109/L范围内线性良好，实测值与理论值密切相关(R2= 0.993)。该仪器计数血小板的准确性是准确检测血小板聚集率的基础，故本研究将该仪器检测的血小板计数值与参考方法进行比对。结果显示在高值血小板样本和中值血小板样本中，2种方法计数结果的相对偏差均在要求范围内(≤20%)，而相对偏差≥20%的样本均为血小板低值样本，精密度与准确性的结果均表明PL-11血小板分析仪虽已完全满足WS/T 406-2012中规定的要求，但在计数低值血小板样本方面还可以进一步改进。

在血小板聚集率的检测方面，光比浊法被认为是国内检测血小板聚集率的“金标准”，血栓弹力图也是近年比较权威的检测方法。本研究对未服用过抗血小板聚集类药物的2型糖尿病患者给予单独服用氯匹格雷治疗后，分别采用PL-11血小板分析仪、光比浊法及血栓弹力图检测患者服药前、后的血小板聚集率。结果显示PL-11血小板分析仪、光比浊法及血栓弹力图在检测血小板聚集率方面有较好的对比性，其结果差异无统计学意义(P＞0.05)。但用药前和用药后的血小板聚集率差异明显(P＜0.05)，说明氯匹格雷具有较好的抗血小板聚集功能。但在观察过程中也发现个别患者的血小板聚集功能在用药前后变化并不是很大，其可能原因与以下因素有关，如遗传变异性、患者依从性、用药剂量不足、CYP3A4相关药物间的相互作用等。有研究发现，突变的基因型CYP2C19*2和CYP2C19*3可能与氯匹格雷的低反应性临床表现有关［7-8］。由于本研究的样本数少，检测条件有限，且血小板在体外不稳定，致血小板体外活化的因素诸多，故仍需进一步深入研究。

抗血小板药物治疗被广泛应用于糖尿病［9］及心血管疾病［10］。评价和提高患者服药效果更依赖于准确、有效地监测抗血小板药物的疗效。只有操作简便、快速，检测结果稳定、可靠的分析仪器才能满足临床实际工作的需要。

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［3］National Committee for Clinical Laboratory Standards.Preliminary evaluation of quantitative clinical laboratory methods［S］.EP10-A2，NCCLS，2002.

［4］National Committee for Clinical Laboratory Standards.Evaluation of the linearity of quantitative measurement procedures:a statistical approach approved［S］.EP6-A，NCCLS，2003.

［5］STEINHUBL SR，MOLITERNO DJ.The role of the platelet in the pathogenesis of atherothrombosis［J］.Am J Cardiovasc Drugs，2005，5(6):399-408.

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Perform ance evaluation of PL-11 p latelet analyzer in the detection of p latelet count and p latelet aggregation

CAI Yuchan，ZHAO Xuhong，HAN Ping，CHEN Changming，LI Zhi.(Department of Clinical Laboratory，Yangpu Hospital，Tongji University，Shanghai 200090，China)

ObjectiveTo investigate the performance of PL-11 platelet analyzer in the detection of platelet count and platelet aggregation.MethodsAccording to the instrument performance verification standards in the Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)and the Health Industry Standard of the People＇s Republic of China，WS/T 406-2012:the Quality Standard of Routine Tests in Clinical Hematology，the performance of PL-11 platelet analyzer in the detection of platelet count and platelet aggregation were evaluated.Platelet aggregation rate in healthy subjects was compared for correlation，which was detected by PL-11 platelet analyzer，LBY-NJ4 platelet tester and TEG-5000 thromboelastogram.ResultsThe within-run and inter-day precisions of PL-11 platelet analyzer were＜1/3 of total error (7%)，and the carry-over rate was 0.32%.In(4.12-1 380.4)×109/L linear range，the regression equation slope was 1.03(R2=0.993).The coincidence rate for platelet count by PL-11 platelet analyzer with reference method was 84%.There was no statistical significance of platelet aggregation rate among PL-11 platelet analyzer，LBY-NJ4 platelet tester and TEG-5000 thromboelastogram in 79 patients with type 2 diabetes mellitus(P＞0.05).However，there was statistical significance in platelet aggregation rates before and after taking clopidogrel hydrogen(P＜0.01).ConclusionsPL-11 platelet analyzer can provide accurate and reliable results for platelet count and aggregation.

Platelet aggregation;Platelet analyzer;Continuous platelet count;Performance evaluation

1673-8640(2015)09-0926-05

R446.62

A

10.3969/j.issn.1673-8640.2015.09.014

2014-12-25)

(本文编辑:范基农)

蔡玉婵，女，1983年生，硕士，主管技师，主要研究方向为抗血栓性疾病治疗的机制。

李智，联系电话:021-65690520。