抗菌剂抗菌性能测定与抗菌效果评价技术研究

陈国妮，孙飞龙，闫亚茹，朱维娜

（西安工程大学环境与化学工程学院，陕西 西安 710048)

综述与进展

抗菌剂抗菌性能测定与抗菌效果评价技术研究

陈国妮，孙飞龙，闫亚茹，朱维娜

（西安工程大学环境与化学工程学院，陕西 西安 710048)

综述了有机、无机、天然抗菌剂的特点，抗菌性能测定及评价技术，抗菌剂的展望与发展前景。详细介绍了抗菌剂抗菌性能的各种定性和定量测试方法，对实验方法和评价技术标准及体系做了全面的搜集与整理，并指出抗菌剂的研究与应用必将成为日用品领域发展的一个重要方向。

有机抗菌剂；无机抗菌剂；天然抗菌剂；性能测定

现今，在抗菌材料被广泛利用的趋势下，抗菌剂的研制与开发正成为新兴抗菌材料添加助剂研究领域的热点之一，因此，合理地测定和科学评价这些新型材料的抗菌性能，对于促进抗菌产品市场的蓬勃发展至关重要。在抗菌剂的测试方法中，国际上最有代表性且发展较快的是日本、美国、德国等发达国家，常见的抗菌标准有AATCC（American Association of Tex-tile Chemists and Colorists）[1]、ASTME（美国材料协会抗菌标准）、JISZ（日本抗菌标准）等[2]。而我国在参考国际标准的基础上，相应制订了FZ/T 01021-1992《织物抗菌性能试验方法》[3]，GB 15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》等标准[4]。但总体而言，在国际范围内对于抗菌性能测定方法与评价标准还没形成一个统一、规范的体系，尤其在我国还存在诸多问题不明确，只是能进行一些简单的定性测试。

目前，由于我国对各类抗菌剂抗菌性能的测定方法与抗菌效果评价标准还不够全面、统一，进而不能满足国内生产和对外需求，因此，本文从无机、有机、天然三方面，对国内外现有的较权威的抗菌测定方法及评价指标进行系统地对比、研究与总结，以便为更多新型抗菌剂在抗菌测定方法及评价标准的使用提供指导作用。

1 抗菌剂的分类及特点

抗菌剂，能够在一定时间内，使微生物的生长或繁殖保持在一定水平之下，可起到抑菌作用。抗菌剂主要分为无机、有机和天然三大类别，其类型与特点见表l。

表1 抗菌剂的类型与特点

2 抗菌剂的性能测定

2.1 无机系抗菌剂的抗菌性能测定

2.1.1 定性测定方法

定性测定方法主要有国外的AATCC Test Method90《Halo Test，琼脂平皿法》、AATCC-30《抗菌剂材料抗霉菌和抗腐烂性能的评定》、JISZ 2911-1981《抗微生物性实验法》 以及国内的GB/T 20944.1-2007《抗菌性能的评价:琼脂扩散法》等[5]。定性测定方法就是简单地在抗菌剂上接种供试菌，一段时间后观察其生长状况。优点是成本低，耗时短；缺点只局限于定性测定，且测定结果也不精确。

2.1.1.1 国外定性测定法

AATCC-90测定法是根据抑菌范围幅度来定性抗菌活性的方法。原理是用含抗菌剂的样品紧贴已接种供试菌的培养基，培养后与对照组比较抑菌圈的大小。此法优点处理量大，操作简便快速，周期短；不足是无法判定供试菌液浓度，也不能定量评定抗菌活性[6]。

对AATCC-90测定法的改良有AATCC-90喷雾法和AATCC-90比色法。但是这两种方法不适用于无琥珀酸脱氢酶的试验菌。

无机抗菌剂抗菌性能定性测定法还有欧洲的EN ISO 20645-2004《抗菌活性的测定 琼脂扩散木片试验》、EN ISO 20743-2007《纺织材料 抗菌成品抗菌活性的测定》、EN 14119-2003《织物检验 微真菌作用的评价》等。

此外，对含抗菌剂材料抗霉菌和抗腐烂性能的评定方法有JISZ 2911抗霉菌测定法和AATCC-30测定法。JISZ 2911抗霉菌测定法是依据霉菌的长势来判定抗菌剂的抗霉菌性能。AATCC-30是根据抗菌剂对霉菌的耐受度，来评定抗菌剂抗菌性能的有效性[7]。

2.1.1.2 国内定性测定法

GB/T 20944.1-2007《抗菌性能的评价第1部分:琼脂扩散法》，是国内制定的定性测定无机抗菌剂的一种方法。培养皿内下层为无菌培养基，上层为接种培养基，加试样培养，根据细菌繁殖的程度，定性评定试样的抗菌性能[8]。

2.1.2 半定量测定法

无机抗菌剂抗菌性能半定量测定法中应用较多的是平行划线法，可相对快速、方便精确地定性测试抗菌剂的抗菌性能，取代了复杂、耗时的AATCC-100。AATCC-147可半定量分析抗菌剂的抗菌性，事先用供试菌接种液在琼脂平板培养皿中划线，然后将抗菌剂试样滴加于培养皿划线处，用划线周围抑菌区的宽度来表征抗菌剂的抗菌能力。

2.1.3 定量测定法

定量测定的标准主要有:美国AATCCTest Method 100《菌数测定法》、ASTME 2149-2001《固着性抗菌剂抗菌性的动态测试法》，日本JISL1902-8(1998)《定量测试法》，我国FZ/T 02021-1992《改良的奎因(Quinn)测试法》、GB/T 20944.2-2007《抗菌性能的评价 第2部分:吸收法》等。定量测定方法较定性法更加科学、准确，不足是周期长、成本高。

2.1.3.1 国外定量测定法

AATCC Test Method 100测定法，能对抗菌剂的抑菌、杀菌效力进行定量地测试。原理是将供试菌分别接种于待测样和对照样，离心并分离出活菌，用平板培养计数法测菌浓度，算出待测样上菌的减少量[9]。该法的优点是适用于大多数无机抗菌剂试样的性能评价。缺点是处理量小、时间长，菌液营养过于丰富，实验条件苛刻，容器太大，不易操作[10]。

ASTME 2149-2001是一种振荡测试法，在一定液体中接种细菌，对于含抗菌剂试样的吸水性要求不高，对非溶出型和溶出型抗菌材料的测试都非常适用[11]。

JISL1902-8(1998)定量测定法，是日本标准制定研究中心在美国AATCC Test Method 100法的基础上，对JISL1902-1990测定法加以改进并完善，提出了JISL1902-8(1998)测定法[12]。

2.1.3.2 国内定量测定法

FZT 01021-1992(简称FZ/T法)抗菌剂抗菌性能测定方法，是我国推出的定量测定标准，通过对比待测样菌液前后的变化，来计算菌的减少量。

改良的奎因(Quine)测定法，在含抗菌剂的待测物上滴加供试菌液，观察比较菌落变化情况，判断其抗菌性大小[13]。

GB/T 20944.2-2007《抗菌性能评价第2部分:吸收法》是国内制定的一种定量测定方法。将供试菌接种于待测样与对照样，依次淋洗，对洗脱液中的细菌计数并算出其减少率，来评价抗菌能力[14]。

2.2 有机系抗菌剂的抗菌性能测定

2.2.1 有机抗菌剂抗菌性能评价方法

有机抗菌剂抗菌性的评价指标有直接计数法、抑菌率和抑菌圈法。抑菌率和抑菌圈法是常用的评价指标，其中抑菌率是定量指标，公式R/%=(A-B)/ A×100%，R为抑菌率；A为对照样品上的平均菌落数；B为抗菌试样平均菌落数。

2.2.2 有机抗菌剂抗菌性能测定方法

2.2.2.1 抑菌圈法

抑菌圈法[15]是检测有机抗菌剂抗菌性的定性方法，抑菌圈的大小可表征抗菌效果的显著。该法是将抗菌剂涂布于特定供试菌的琼脂培养基内成立体状扩散，抗菌剂抑制供试菌繁殖，就会在其周围出现透明圈，通过抑菌圈大小可评价抗菌剂抑菌活性大小。该方法操作简单，但重现性差、准确性不高。

2.2.2.2 贴膜接触抑菌法

该法是测定有机抗菌剂抑菌性的定量方法，能够说明有机抗菌剂的接触抑菌机制和抗菌功能。将待测样与对照样溶于平板培养基，分别滴加供试菌液并覆盖灭菌薄膜，培养一定时间后洗脱菌液，测菌浓度来评价抗菌性能。

此外还有浸渍培养法，适用于表面粗糙的纤维制品和树脂成品中抗菌剂的抗菌性能测定。接触法或包埋法，适合于抗菌材料抗菌性的进一步探究，但不能作为定量检测，且测定时间较长。

2.2.3 抗真(霉)菌的测试方法

2.2.3.1 接触法

与贴膜接触抑菌法一致，国际上ISO 846、BS1982Pt.3-90、ASTMG21-96、JISA2911-81、DIN 53793等标准都采用此方法。

2.2.3.2 暴露法

是把试样暴露于霉菌生长的场所过后再测试样长霉的情况。国家标准GB 242316-1991、GB/T 4768-1995等采用此方法。

2.3 天然生物系抗菌的剂抗菌性能测定

生物抗菌剂抑菌活性测定方法有琼脂扩散法和连续稀释法。琼脂扩散法包括滤纸片扩散法、管碟法、挖沟法和打洞法，其中滤纸片扩散法中抗菌剂在纸片上的装载量小，管碟法和挖沟法对仪器要求较高，打洞法抗菌剂的装载量过大，扩散效果不容易控制，灵敏度较低[16]。一般对天然抗菌剂活性的研究建议采用灵敏度较高的管碟法或挖沟法。

2.3.1 管碟法

管碟法作为法定的生物抗菌剂检定方法，已被各国药典广泛采用。管碟法就是利用有一定体积的不锈钢制的小管（牛津杯），将生物抗菌剂溶液装满小杯，一定时间后，可产生透明抑菌圈。抑菌圈的大小衡量抗菌剂抗菌性能，将已知的抗菌剂标准液先制成标准曲线，比较标准液与待测抗菌剂的抑菌圈大小，就可算出待测抗菌剂的抗菌性能[17]。

2.3.2 平板打洞法

将抗菌剂配成不同浓度的溶液，过滤除菌备用。在无菌条件下，在灭菌过的培养皿内注入相应菌种的固体培养基，制成平板，吸取供试菌悬液到培养平板上。用打孔器在培养基上打出一定直径的孔，每孔加入适量的抗菌剂溶液，以无菌蒸馏水作空白对照。抗菌剂溶液扩散，使其周围的测试菌生长受到抑制而形成透明的抑菌圈[18]。

2.3.3 试管法

将平板打洞方法中刚刚出现阳性效果（有抑菌圈）的抗菌剂，在液体培养基中设置多个浓度梯度；取一定量各菌悬液，分别加入到含有各抗菌剂的液体培养基中，摇匀培养。培养结束后，进行平板的涂抹培养，测其最低抑菌浓度（MIC），判断抑菌能力[19]。

此外还有梯度稀释-活菌计数法[20]和滴下法[21]。梯度稀释-活菌计数法是将待测样品制成均匀的系列浓度梯度稀释液，再分别加入到抗菌剂药物中，一定时间后，取样进行活菌数计数，从存活的细菌数量计算出抗菌剂对试验菌的致死率，从而判断抗菌剂的杀菌能力。滴下法用于具有吸水性的抗菌剂食品检测。

3 前景与展望

本文从无机、有机、天然三方面，对目前世界上使用较多的抗菌测试方法及评价标准进行了系统的对比、归类与总结，这将对更多新型抗菌剂的研究和开发提供一定的理论基础，在实验方法、评价方法、测试标准等的使用过程中都能给予一定的指导作用。

随着人们生活水平的提高和科研技术的发展，抗菌剂在抗菌材料中的应用技术将会更加成熟，更多新型抗菌材料会越来越受到人们的青睐，进而在家电、日常用品、化学器件、公共设施等领域得到更广泛的应用。抗菌剂的研制与开发正成为新兴抗菌材料添加助剂研究领域的热点之一。

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Antibacterial Property Measurement Technology and Antibacterial Effect Evaluation

CHEN Guo-ni，SUN Fei-long，YAN Ya-ru，ZHU Wei-na
(School of Environment & Chemical Engineering, Xi’an Polytechnic University, Xi’an 710048, China)

The antibacter ial agent characteristics, antibacterial property measurement and evaluation technology, the prospect and development trend of the research on organic, inorganic and natural antibacterial agents both at home and abroad were reviewed in this paper.The various qualitative and quantitative test methods of antibacterial performance were introduced in detail.The standards and systems of the experiment and evaluation methods were collected and organized across the board.The research and application of antibacterial agent would become an important direction of development of the f eld of daily products.This study may be valuable for the research, development and application of new antibacterial agent.

organic antibacterial agent; inorganic antibacterial agent; natural antimicrobial agent; property measurement.

TQ 455

A

1671-9905(2015)02-00-

西安工程大学博士科研启动项目(BS1011)；陕西省大学生创新训练项目(1238)

陈国妮( 1989-)，女，陕西人，研究生，硕士，电话:15114866196，E-mail: 240376704@qq.com

孙飞龙，副教授，博士，电话:02982330177，E-mail: sunfeilong@xpu.edu.cn

2014-11-14